双阴性T淋巴细胞在儿童腺病毒肺炎患儿中的变化及意义探讨①

李权恒 董伟然 李金英 高文杰 徐丽娟 张中馥 张丽君

（河北省儿童医院急诊科，石家庄050031）

腺病毒是儿童肺炎常见病原，近1/3 可发展为重症腺病毒肺炎，甚至引起呼吸窘迫综合征而导致死亡，并可遗留不同程度的后遗症，严重影响儿童的生活［1］。重症腺病毒发生除与病毒表型和载量有关外，病毒感染后免疫功能紊乱和机体免疫功能低下也可导致其发生、发展［2］。双阴性T 淋巴细胞（double negative T cell，DNT）是一特殊类型T 淋巴细胞，具有一定的抑制性免疫调节作用，参与自身免疫性疾病、肿瘤性疾病以及移植排斥反应的发生发展过程［3-6］。为探讨DNT 在腺病毒肺炎中的变化以及与患儿病情严重程度的关系，本文对症腺病毒肺炎患儿外周血淋巴细胞亚群的水平进行分析，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 资料 选择 2016 年 1 月至 2019 年 12 月在河北省儿童医院呼吸一科住院诊断为腺病毒肺炎患儿为研究对象，病例纳入标准：①腺病毒肺炎诊断标准：根据临床表现及胸部影像学诊断为肺炎的患儿，并鼻咽部分泌物或痰腺病毒DNA 阳性。根据病情严重程度分为轻症腺病毒肺炎、重症腺病毒肺炎两组，病情严重程度参照2019 年国家卫生健康委制定的《儿童社区获得性肺炎诊疗规范》［7］；②年龄1 月~6 岁，性别不限；③近两周之内无严重感染性疾病、未使用过糖皮质激素类药物；④无免疫缺陷病史、自身免疫性疾病、先天性心脏病、血液系统疾病及其他严重基础疾病者；⑤临床资料完善。共入组312 例，其中轻症腺病毒肺炎患儿197 例，重症腺病毒肺炎患儿115例。并选同期在保健科进行健康体检的60 例儿童作为健康对照组，其中男41 例，女19 例。本研究经我院伦理委员会批准，家属知情同意。

1.2 方法 所有患儿及正常对照组儿童均由护士取得血样后送检，送检后8 h 内由我院儿研所专门医师应用美国贝克曼库尔特公司FC500型流式细胞仪严格按操作手册及试剂盒说明书对患儿外周血淋巴细胞亚群百分比，CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD3+CD4−CD8−、CD3+CD4+CD8+、CD19+、CD56+进行检测，并记录。正常参考范围：CD3+∶60%~82%；CD4+∶35%~58%；CD8+∶20%~35%；CD4+/CD8+∶0.7%~2.5%；CD3+CD4−CD8−（DNT）∶<6.7%；CD3+CD4+CD8+∶<2.0%；CD19+∶5%~18%；CD56+∶4%~18%。

1.3 统计学方法 应用SPSS26.0软件进行数据分析，正态分布的计量资料以表示，组间采用重复测量方差分析，非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney 秩和检验，计数资料采用n表示，组间比较采用卡方检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较 共入组腺病毒肺炎患儿312例，男 202 例，女 110 例，平均年龄 16.5（11，35）月龄，轻症腺病毒肺炎患儿共197 例，其中男125 例，女72例，平均年龄17（11，39）月龄，重症腺病毒肺炎共115例，其中男77例，女38例，平均年龄16（11.5，36）月龄，正常对照组儿童60 例，其中男41 例，女19例，平均年龄21.5（15，36）月龄。三组的年龄、性别比较差异无统计学意义（P>0.05）。对腺病毒肺炎患儿进行年龄分层，轻症腺病毒肺炎组和重症腺病毒肺炎组各年龄段性别、年龄比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 两组腺病毒肺炎患儿年龄分层比较［M（P25，P75）］Tab.1 Comparison of age stratification between two groups of children with adenovirus pneumonia［M（P25，P75）］

2.2 不同组间外周血T 淋巴细胞亚群水平比较 见表2，三组比较CD3+、CD4+、DNT、CD3+CD4+CD8+、CD19+百分比差异有统计学意义（P<0.01），其余指标差异无统计学意义（P<0.01）；与正常对照组相比轻症腺病毒肺炎组和重症腺病毒肺炎组CD3+、CD4+、DNT 百分比下降，重症腺病毒肺炎组下降更显著（P<0.05）；CD19+百分比在正常对照组与重症腺病毒肺炎组及轻症与重症腺病毒肺炎组比较差异有统计学意义（P<0.05），而正常对照组组与轻症腺病毒肺炎组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表2 不同组间外周血T淋巴细胞亚群水平比较［，M（P25，P75）%］Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood between different groups［，M（P25，P75）%］

表2 不同组间外周血T淋巴细胞亚群水平比较［，M（P25，P75）%］Tab.2 Comparison of T lymphocyte subsets in peripheral blood between different groups［，M（P25，P75）%］

Note：Compared with normal control group，1）P<0.05；Compared with severe adenovirus group，2）P<0.05.

CD3+68.73±6.0438.53±6.48 Normal control（n=60）Mild adenovirus pneumonia（n=197）Severe adenovirus pneumonia（n=115）Z/ F P 22.73±5.24 22.52±6.50 64.20（56.40，69.30）1）2）34.90±9.301）2）21.40（17.40，26.00）1.60（1.40，2.20）1.60（1.20，2.10）7.10（4.80，8.40）4.30（2.90，6.00）1）2）0.10（0.00，0.10）0.10（0.10，0.20）1）24.60（17.90，31.00）5.80（3.40，8.30）6.20（3.60，9.80）6.50（3.70，9.50）1.017 0.601 58.74±12.301）31.81±10.281）27.91±11.71）34.283 0.000 19.043 0.000 20.70（16.50，25.40）2.111 0.348 1.60（1.00，2.00）4.633 0.099 3.50（2.40，5.00）1）53.877 0.000 0.10（0.00，0.20）1）18.253 0.000 9.938 0.007 CD4+Groups CD8+CD19+CD4+/ CD8+CD3+CD4−CD8−CD3+CD4+CD8+CD56+

2.3 腺病毒肺炎患儿外周血T 淋巴细胞亚群按年龄分层比较 0~1 岁和3~6 岁轻症、重症腺病毒肺炎患儿外周血总淋巴细胞亚群各指标比较差异均无统计学意义（P>0.05），在1~3 岁年龄段重症腺病毒肺炎患儿CD3+、CD4+、DNT 水平低于轻症腺病毒肺炎组，CD19+高于轻症腺病毒肺炎组，差异均有统计学意义（P<0.05），其余指标比较差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

表3 腺病毒肺炎患儿外周血T淋巴细胞亚群年龄分层结果比较［，M（P25，P75）%］Tab.3 Comparison of age stratification results of T lymphocyte subsets in peripheral blood of adenovirus pneumonia chil⁃dren［，M（P25，P75）%］

表3 腺病毒肺炎患儿外周血T淋巴细胞亚群年龄分层结果比较［，M（P25，P75）%］Tab.3 Comparison of age stratification results of T lymphocyte subsets in peripheral blood of adenovirus pneumonia chil⁃dren［，M（P25，P75）%］

Age（Years）Groups CD3+CD4+CD8+CD4+/ CD8+CD3+CD4−CD8−CD3+CD4+CD8+CD19+CD56+33.32±11.26 59.88±11.7918.90（15.80，23.50）1.90（1.30，2.70）2.70（1.95，3.45）0.10（0.00，0.20）23.70±10.736.30（3.10，10.70）0~159.44±13.3133.23±11.6920.70（16.40，24.50）1.60（1.30，2.00）3.00（2.20，4.40）0.10（0.00，0.20）27.69±12.636.70（4.50，10.50）1.476 0.143 0.157 0.875−1.484 0.138−1.500 0.134 Mild adenovirus pneumonia（n=69）Severe adenovirus pneumonia（n=44）Z/ F P Mild adenovirus pneumonia（n=98）Severe adenovirus pneumonia（n=54）Z/ F P Mild adenovirus pneumonia（n=30）Severe adenovirus pneumonia（n=17）Z/ F P−1.440 0.15−0.853 0.394−0.064 0.949−0.380 0.704 62.50（55.50，67.80）34.50±8.2221.61±5.771.60（1.20，2.00）5.20（3.60，6.20）0.10（0.10，0.20）25.70（19.50，30.92）6.25（3.77，9.85）1~354.20±10.1329.40±8.7919.60（16.10，25.70）1.60（0.90，2.10）4.95（3.62，6.20）0.10（0.00，0.20）31.34±10.825.40（2.30，8.00）−4.304 0.000 3.578 0.000−0.755 0.45−1.488 0.137−5.497 0.000−1.443 0.149−3.665 0.000−1.675 0.094 67.60（63.10，73.30）34.04±8.4325.10（20.52，28.60）1.40（1.00，1.70）5.65（4.32，7.50）0.10（0.00，0.20）20.10（15.47，25.67）5.35（3.47，9.70）3~667.03±10.3134.47±9.9322.40（17.67，36.90）1.50（1.12，1.90）6.18±3.530.10（0.07，0.30）21.11±8.837.30（3.77，9.37）−0.188 0.851−0.210 0.838−0.856 0.392−0.632 0.527−0.370 0.714−0.166 0.869−0.188 0.851−0.470 0.638

3 讨论

腺病毒是儿童呼吸道感染常见病原，其导致的儿童重症肺炎占儿童重症肺炎20%以上，在进行机械通气的儿童重症肺炎患儿中，腺病毒亦是检出最多的病毒病原，其易造成2 岁以下婴幼儿及存在免疫功能障碍患者的死亡，腺病毒感染后可引起T、B细胞数量及功能的降低，造成Th1/Th2比例失衡，引起机体免疫功能紊乱［8-11］。T 淋巴细胞是参与细胞免疫的主要细胞，按T细胞抗原受体表达不同，分为CD4+淋巴细胞和CD8+淋巴细胞两个亚群，CD3+是T细胞激活的标志物，CD4+是T 细胞应答功能的标志物，CD8+是对非己抗原诱发免疫应答抑制作用的标志物，正常情况下这两种淋巴细胞亚群之间相互协调、相互平衡，使机体处于免疫稳定状态，当机体免疫系统受抗原刺激后，CD3+、CD4+以及CD4+/CD8+降低说明T 细胞对外来入侵的抑制功能降低［12-14］。B 淋巴细胞是体液免疫效应细胞，CDl9+细胞为活化B 细胞，可分泌多种免疫球蛋白和抗体，介导机体的免疫应答，外周血中CD19+分子的表达高低可代表B淋巴细胞水平。

研究表明呼吸道感染患儿CD3+、CD4+水平下降，CD19+水平升高，且随病情加重，CD3+、CD4+水平下降以及CD19+水平偏移越明显［15-16］。呼吸道病毒感染T淋巴细胞改变程度大于细菌感染［17］。腺病毒感染时CD3+、CD4+、CD19+改变程度大于呼吸道合胞病毒，且与病情严重程度有关［18-20］。本研究也发现腺病毒肺炎患儿CD3+、CD4+低于正常对照儿童，且重症腺病毒肺炎患儿CD3+、CD4+降低程度大于轻症腺病毒肺炎患儿，提示腺病毒感染可导致机体细胞免疫功能受损，病情越重损伤程度越明显，且CD19+两组患儿均高于正常值，重症腺病毒肺炎升高更明显，分析考虑与重症腺病毒肺炎细胞免疫功能受损、B 淋巴细胞依赖的T细胞功能受损、B 淋巴细胞产生抗体功能不足有关，造成机体免疫失衡，所以对于重症腺病毒肺炎患儿适当给予免疫调节剂，有助于患儿免疫状态的改善，从而提高治疗效果。

DNT 是T 淋巴细胞的一个独特亚群，既不表达CD4+也不表达CD8+，其在体内调节免疫的作用机制十分复杂，研究发现DNT 可以抑制免疫细胞及炎症因子，对具有相同T 细胞受体的特异性CD8+和CD4+产生抑制作用，发挥免疫抑制功能［21］；DNT 还可通过抗原提呈细胞（antigen presenting cells,APC）途径转变成既表达特异性抗原又表达凋亡相关因子配体 (factor association suicide ligand,FASL )的“杀伤”细胞，并通过其FasL 将凋亡信号传递给CD8+细胞［22］。而 CD4+、CD8+及 DNT 可从 APC 上获得主要组织相容性复合体（major histocompatibility com‑plex，MHC）短肽复合物并将此抗原递呈于其邻近的T 淋巴细胞，从而诱导免疫耐受［23］。在儿童不同病毒感染性疾病中DNT 表达有所不同，EB 病毒引起传染性单核细胞增多症患者中，DNT 处于高表达［24］。而在儿童手足口病的研究中DNT 处于低表达状态［25］。本研究结果发现无论轻症腺病毒肺炎还是重症腺病毒肺炎患儿中都存在一定水平的DNT 细胞，但水平显著低于正常对照儿童，且重症腺病毒肺炎患儿DNT 水平明显低于轻症腺病毒肺炎患儿，提示DNT 可能参与重症腺病毒肺炎发生发展的过程，考虑机制可能为DNT 减少导致其免疫抑制功能降低，从而引起腺病毒肺炎气道炎症调节紊乱的持续存在，但具体机制仍需进一步研究。

有研究表明儿童CD3+、CD8+和CD56+百分比随年龄增长均呈逐渐升高趋势，CD4+、CD19+百分比及CD4+/CD8+比值随年龄增长均呈逐渐降低趋势，男女淋巴细胞升高、降低的程度略有不同［26］。另有研究表明，学龄前儿童随年龄增长CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD19+呈下降趋势，而 CD56+、CD8+呈上升趋势［27］。还有研究表明CD3+在婴儿期后保持相对稳定［28］。本研究对入组患儿进行年龄分层研究发现轻症腺病毒肺炎患儿 CD3+、CD4+、CD8+、DNT 随年龄增长呈上升趋势，CD4+/CD8+、CD56+随年龄增长呈下降趋势，而重症腺病毒肺炎患儿仅DNT 随年龄增长呈上升趋势，其余指标均与年龄无显著性差异，且只有 1~3 岁年龄组患儿 CD3+、CD4+、DNT、CD19+轻、重症腺病毒肺炎比较差异有统计学意义，提示腺病毒感染1~3岁儿童可引起更加严重的免疫功能的紊乱，考虑与1 岁以内的患儿带有一定的母体免疫，3 岁以上儿童免疫功能逐渐完善，1~3 岁患儿免疫功能发育不完善有关。

综上所述，腺病毒感染人体后引起临床症状轻重与机体免疫功能紊乱有关，病情越重细胞免疫抑制程度越明显，尤其是对于1~3 岁儿童，CD4+、CD8+T 细胞是介导腺病毒感染的免疫应答主要细胞，DNT 减少导致其免疫抑制功能降低，从而进一步加重免疫功能紊乱状态，促进病情的进一步加重，所以对腺病毒肺炎患儿进行外周血淋巴细胞亚群测定可为预测病情的发展提供一定依据。