前胡汤对急性支气管炎大鼠气道神经源性炎症改善作用机制研究*

朱瑞康 李江 李文韬 颜延凤

(1.南京中医药大学,江苏 南京210023;2.南京中医药大学附属南京中西医结合医院,江苏 南京 210014)

急性支气管炎是临床常见病，可由微生物感染、物理化学刺激因素等诱发，属于中医咳嗽、痰饮、喘证等范畴，目前除了细菌性支气管炎应用抗生素治疗效果确切之外，其余病因患者尚无特效疗法[1,2]。近年来中医及中西医结合治疗急性支气管炎取得较大的进步，但大多数中药复方及成药基础研究不够深入，药物发挥作用的成分和机理尚不明确，使得很多确有疗效的中药临床应用难以推广[3]。

气道神经源性炎症是由气道内感觉神经元的外周神经末梢所释放的速激肽和神经递质所引起，包括：P物质(SP)、神经激肽A(NKA)、神经激肽B(NKB)、降钙素基因相关肽(CGRP)等，表现为血管通透性增高、血浆蛋白外渗、气道平滑肌收缩、黏液分泌增多和组织充血水肿等[4-5]。气道神经源性炎症在多种呼吸道疾病中均发挥重要的作用，而关于中医药对急性支气管炎相关气道神经源性炎症干预研究的文献报道极少。前胡汤由前胡10 g、杏仁10 g、桑叶15 g、生甘草6 g组成，来源于《温病条辨》中的杏苏散和桑菊饮，临床上可用于急性支气管炎治疗[6-7]。本研究通过建立大鼠急性支气管炎模型，探讨前胡汤对气道神经源性炎症相关机制的调节作用，为其临床防治急性支气管炎提供实验依据。

1 材料与方法

1.1药物及试剂 前胡汤水煎液，参照郑桥医案选“自拟前胡汤”，组方：前胡10 g，杏仁10 g，桑叶15 g，生甘草6 g。中药饮片均由南京市中西医结合医院中药房采购及质控，根据常规方法煎制浓缩为1.37 g(生药量，下同)/kg的药液，4 ℃冰箱保存备用；急支糖浆(批号：18120437)，太极集团重庆涪陵制药厂有限公司；美敏伪麻溶液(惠菲宁，批号：AL7483)，Wyeth惠氏制药有限公司。红梅香烟(84mm烤烟型)，红塔烟草(集团)有限责任公司生产；大鼠SP、NKA、NKB、CGRP和神经生长因子(NGF)试剂盒，南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液(强)、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、DEPC水，碧云天生物科技研究所；RNA Isolator(R401-01)、HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(R123-01)，南京诺唯赞生物有限公司；30%丙烯酰胺，生工生物工程(上海)股份有限公司；过硫酸铵(7727-54-0)，国药集团化学试剂有限公司；GAPDH、NK-1、VR1和p38 MAPK抗体，英国Abcam公司；其余试剂均为市售分析纯。

1.2实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体重180-200 g，上海市西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2018-0006。

1.3主要设备仪器 -20 ℃低温冷冻冰箱(BCD-249CF)，合肥美菱股份有限公司；-80 ℃超低温冰箱，美国Thermo公司；中通量组织研磨仪，北京鼎昊源科技有限公司；mini-PROTEAN 3 Cell电泳槽、GelDocXR 凝胶成像仪、梯度 PCR仪(MyCycler)，美国Bio Rad公司；电子分析天平(BSA124S)，德国赛多利斯科学仪器有限公司；NanoDrop2000 超微量分光光度计(NP2000)、纯水仪、多功能酶标仪(3020-183)、实时荧光定量PCR仪(StepOne Plus)，美国Thermo Scientific公司。

1.4方法

1.4.1动物造模及给药 大鼠购入后适应饲养一周，将大鼠随机分为模型组(蒸馏水20 mL/kg)、急支糖浆治疗组(10 mL/kg)、惠菲宁治疗组(10 mL/kg)、前胡汤高剂量治疗组(27.3 g/kg)、前胡汤低剂量治疗组(13.7 g/kg)、空白对照组(蒸馏水20 mL/kg)，每组16只。除空白对照组外，其余各组大鼠参考文献[8-9]，采用烟熏法复制大鼠急性支气管炎模型(每组用锯末和烟丝各50 g置于熏炉内引燃，避免明火，对烟熏箱内大鼠进行烟熏刺激，30分钟/次，2次/日)，连续2周，造模完成后各组大鼠连续给药7天，每天1次。

1.4.2指标检测 分别于给药第3天和第7天，于给药后2h，眼眶采血，采用ELISA试剂盒测定血清中SP、NKA、NKB、NGF和CGRP。分别于给药第3天和第7天，于给药后2 h，每组取8只大鼠，10%水合氯醛麻醉后收集肺泡灌洗液，采用试剂盒测定灌洗液中SP、NKA、NKB、NGF和CGRP水平；大鼠肺泡灌洗完毕，取左肺下叶组织0.3 g左右，制备10%生理盐水匀浆，取上清液按试剂盒要求，用ELISA 法测定SP和NGF水平。

取给药大鼠肺脏组织，采用Real-time PCR以及Western blot分别检测NK-1、VR1和p38 MAPK的mRNA和蛋白表达水平。相关引物序列如下表所示。

Real-time PCR检测引物设计

2 结果

2.1对大鼠血清中神经源性炎症物质水平的影响 与对照组大鼠相比，模型组大鼠血清中神经源性炎症物质水平随造模时间延长而逐步显著升高，其中SP、NKA和CGRP水平自造模第3天开始明显升高(p<0.05，p<0.01)，而造模7天时5种因子水平均显著升高(p<0.05，p<0.01)。与模型组相比，惠菲宁可明显抑制血清中神经源性炎症物质水平，改善作用相对较强(p<0.05，p<0.01)，急支糖浆和高剂量前胡汤对神经源性炎症物质水平也具有明显的改善作用(p<0.05，p<0.01)，低剂量前胡汤改善作用强度相对较弱(表1-1，1-2)。

表1-1 对急性支气管炎大鼠血清中神经源性炎症物质水平的影响

表1-2 对急性支气管炎大鼠血清中神经源性炎症物质水平的影响

2.2对大鼠BALF中神经源性炎症物质水平的影响 与对照组大鼠相比，模型组大鼠BALF中神经源性炎症物质水平随造模时间延长而逐步显著升高，造模第3天开始，5种因子水平均明显升高(p<0.01)，而造模第7天时进一步升高(p<0.01)。与模型组相比，惠菲宁可明显抑制BALF中神经源性炎症物质水平，改善作用相对较强(p<0.05，p<0.01)，急支糖浆和高剂量前胡汤对神经源性炎症物质水平也具有明显的改善作用(p<0.05，p<0.01)，低剂量前胡汤改善作用强度相对较弱(表2-1，2-2)。

表2-1 对急性支气管炎大鼠BALF中神经源性炎症物质水平的影响

表2-2 对急性支气管炎大鼠BALF中神经源性炎症物质水平的影响

2.3对大鼠肺组织中SP和NGF水平的影响 与对照组大鼠相比，模型组大鼠肺组织中SP和NGF水平随造模时间延长而逐步显著升高，造模第3天开始明显升高(p<0.01)，而造模7天时进一步升高(p<0.01)。与模型组相比，惠菲宁可明显抑制肺组织中SP和NGF水平，改善作用相对较强(p<0.05，p<0.01)，急支糖浆和高剂量前胡汤对神经源性炎症物质水平也具有明显的改善作用(p<0.05，p<0.01)，低剂量前胡汤改善作用强度相对较弱(表3)。

表3 对急性支气管炎大鼠肺组织中SP和NGF水平的影响

2.4对大鼠肺组织中NK-1、VR1和p38 MAPK表达量的影响 Real-time PCR结果显示，烟熏造模自第3天可以明显增加肺组织中NK-1和p38MAPK的mRNA表达(p<0.01)，第7天后变化更加显著；但对于VR1的mRNA表达未见显著影响。与模型组相比，惠菲宁对于模型大鼠肺组织NK-1和p38MAPK的mRNA表达具有显著抑制作用(p<0.01)，急支糖浆和前胡汤也有不同程度的抑制作用(p<0.05，p<0.01)。各受试药物组对模型大鼠肺组织VR1的mRNA表达均未见明显影响(图1)。

图1 前胡汤对急性支气管炎大鼠肺组织中SP通路相关分子mRNA表达水平的影响(M±SD，N=8)**p<0.01，与对照组相比；#p<0.05，##p<0.01，与模型组相比。

Western blot结果显示，烟熏造模自第3天可以明显增加肺组织中NK-1和p38 MAPK的蛋白表达(p<0.01)，第7天后变化更加显著，而VR1蛋白表达水平未见明显变化，蛋白水平变化趋势与mRNA表达水平一致。与模型组相比，惠菲宁对肺组织NK-1和p38 MAPK的蛋白表达具有显著抑制作用，急支糖浆和前胡汤也有不同程度的抑制作用。各受试药物组对模型大鼠肺组织VR1的蛋白表达均未见明显影响(图2)。

图2 前胡汤对急性支气管炎大鼠肺组织中SP通路相关分子蛋白表达水平的影响(C：对照组；M：模型组；JZT：急支糖浆组；HFN：惠菲宁组；QTH、QTL：前胡汤高、低剂量组)

3 讨论

SP、NKA和CGRP等神经肽类分布于呼吸道C纤维末梢中，它们通过多种形式影响气道组织并可诱发神经源性炎症[10,11]。气道神经源性炎症发病机制在于感染及炎症刺激导致气道上皮损伤甚至脱落，导致上皮下感觉神经元末梢暴露于炎症介质而易被刺激，使得神经肽或递质释放增多[12,13]。增多的神经肽类物质可直接刺激感觉神经末梢导致咳嗽敏感性增高；也可以收缩气道平滑肌、增加气道腺体分泌、扩张血管和增加血管通透性、活化气道炎症细胞等促进气道炎症反应的发生和发展[14-15]。本实验中模型组大鼠血清、BALF和肺组织中SP、NKA、NKB 和CGRP等神经源性炎症物质水平随造模时间延长而逐步显著升高，表明气道神经源性炎症参与了急性支气管炎的病理过程，而前胡汤可明显抑制模型大鼠体内神经源性炎症物质水平，抑制作用具有一定的剂量相关性。

NGF是气道神经源性炎症的上游调控因子，其与神经肽共同调控气道炎症反应。在炎症刺激下，NGF受体表达上调，由神经元的轴突末稍摄取，逆行运输到背根节，使神经元敏感性增加，释放SP，介导神经源性炎症[16]。SP是气道神经源性炎症的核心介质，更是导致咳嗽敏感性增高的重要因素[17]。其与NK1结合，作用于多种效应细胞(包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞)等，引起气管渗出、气道收缩，介导气道神经源性炎症，导致咳嗽敏感性增高[18,19]。蛋白激酶 p38属于丝裂原活化蛋白激酶 MAPK家族，是细胞生物信号跨膜传递的重要信号分子，在机体炎症反应中具有广泛的参与，是炎症反应的关键指标之一[20]。p38 MAPK是SP的重要下游信号分子，SP可以通过NK1受体，激活p38 MAPK，进而活化免疫细胞，释放炎症介质[21]。与正常大鼠相比，模型组大鼠肺组织中NGF和SP水平随造模时间延长而逐步显著升高，且肺组织中NK-1及p38 MAPK的mRNA和蛋白表达显著上调，表明NGF/SP/p38 MAPK通路参与了此模型呼吸道炎症反应，而前胡汤可明显抑制模型大鼠肺组织内此通路信号分子水平，抑制作用具有一定的剂量和时间相关性。

VR1属于瞬时受体电位类香草酸受体亚型[22]。呼吸道C纤维末梢上有VR1的功能性表达，在呼吸道疾病中，VR1可作为感受器将刺激信息传至中枢神经，也可以作为效应器，引起局部炎症，即气道神经源性炎症[23]。VR1常与神经肽在同一轴突中共存在，VR1活化可诱导C纤维末梢释放神经肽SP等[24,25]。本实验中，模型大鼠肺组织中VR1的mRNA和蛋白表达水平均未见显著改变，而前胡汤等治疗组对VR1的表达水平也未见明显影响，提示VR1在此模型中作用较弱。

综上，烟熏可引起大鼠出现明显的急性支气管炎症反应，同时伴有神经源性炎症物质水平显著升高，提示炎性分子信号通路被激活和神经源性炎症反应的参与。前胡汤灌胃给药对于此模型气道神经源性炎症具有较好的改善作用，其作用机理与调节NGF/SP/p38 MAPK信号通路有关。