维生素D与精神分裂症间的关联及其检测方法的研究进展

周素芹, 魏蕴哲, 汪 昕, 薛 永, 茆 平

(1. 淮阴工学院 化学工程学院，江苏 淮安 223003；2. 淮安市第三人民医院 检验科，江苏 淮安 223001)

自1930年，德国的Windaus确定维生素D的结构以来，科研人员对于维生素D的研究从未间断[1-5]，对维生素D在人体中的产生、运输、作用以及代谢机理进行了系统的研究。维生素D是类固醇激素家族的一员，主要有维生素D2[麦角骨化醇，9,10-开环麦角甾-5,7,10(19),22-四烯-3β-醇]、维生素D3[胆骨化醇，9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-3β-醇]、维生素D4(22,23-二氢麦角钙化醇)和维生素D5[(5Z,7E)-9,10-开环豆甾-5,7,10(19)-三烯-3β-醇]，其分子结构见图1。

图1 维生素D分子结构

维生素D因其在促进钙吸收，维持适当的钙、磷浓度中发挥重要作用而被大众熟知。然而，其在调节免疫反应和代谢激素的过程中同样扮演着重要的角色，它能够修饰多种基因编码的蛋白质以及调节部分细胞的增殖、分化和凋亡过程，改善神经营养因子水平，维持神经元密度，从而起到保护神经的作用[6]。此外，维生素D还能够影响神经传递和突触的可塑性[7]。人体血清中的维生素D主要以维生素D3的形式存在。它可以通过膳食摄入或由皮肤中的7-脱氢胆固醇经紫外线照射转变而来，在空肠和回肠与脂肪一起被吸收后，与乳糜微粒一同由淋巴系统运输或由维生素D运输蛋白(α-球蛋白部分)在血浆中运输。当其被运送至肝脏后，在25-羟化酶作用下，代谢生成25-羟基维生素D3。这一物质通常被作为测量维生素D状态的前激素。当人体缺乏维生素D时，25-羟基维生素D3在甲状腺素的作用下经肾脏进一步代谢成具有生物活性的1,25-二羟基维生素D3[8]。维生素D在人体中的代谢机理见图2。

图2 维生素D在人体中的代谢机理

维生素D的生物学行为离不开维生素D受体(VDR)的介导[9]。VDR是一类亲核蛋白，属于类固醇激素/甲状腺激素受体超家族成员。由肾脏代谢产生的1,25-二羟基维生素D3激素信号分子在靶细胞与VDR结合后会形成一种受体复合物，当该复合物作用于靶基因上特定的DNA序列时，它能够调节结构基因的表达。研究证明，VDR普遍存在于神经元和神经胶质细胞乃至整个大脑、脊髓和周围神经系统中，这也预示着维生素D缺乏将会使得神经系统的失调，进而导致精神分裂症等精神疾病发病率的提高[10]。本文概述了近年来关于维生素D与精神分裂症关联性的研究以及维生素D常用的检测方法，为后续进一步研究二者联系提供参考依据。

1 维生素D与精神分裂症之间的关联性

精神分裂症是一种以一系列显著的精神和行为障碍为特征的精神疾病，有着较高的致残率。其临床症状包括：阳性症状(幻觉、妄想等)和阴性症状(情感淡漠、意志缺乏等)以及认知能力低下等。2014年，Clelland等[11]比较了64例精神分裂症患者与90名健康人对照组的空腹血清中25-羟基维生素D [25(OH)D]的含量，结果表明，精神分裂症患者血清中的25(OH)D水平显著低于对照组，并且经分析得出25(OH)D的缺乏与精神分裂症具有相关性。此外，临床上观察性研究表明，维生素D缺乏的人患精神分裂症的发病率是正常人的2.16倍，这项研究同样证明了缺乏维生素D与精神分裂症之间有着重要的联系[12]。随后，Shivakumar等[13]研究了未服用抗精神病药物的精神分裂症患者血清中维生素D水平与其海马灰质体积之间的联系(35例)，应用25-羟基维生素D免疫法测定患者血清中的维生素D含量，并采用形态计量学方法分析患者的海马灰质3-Tesla磁共振成像(MRI)图像(切片厚度1 mm)。根据精神分裂症患者血清中25(OH)D水平与海马灰质的体积的成正相关，发现97%的精神分裂症患者缺乏维生素D。2017年，Salavert[14]对45例精神病首次发病的患者和22例相同年龄的健康对照者血清中的25-羟基维生素D进行检测，将这45名患者分为精神分裂症患者(22例)和其他精神病患者(23例)两类，发现这些患者普遍缺乏维生素D，特别是其中22例精神分裂症患者。不久后，Eyles等发现新生儿缺乏维生素D会导致后期患精神分裂症的风险显著增大。对于那些在干血斑检测中测出25-羟基维生素D含量低于20.4 nmol/L(符合维生素D缺乏的标准定义)的新生儿，患精神分裂症的风险增加了44%。此外，新生儿血清中的25-羟基维生素D浓度与出生时其母亲血清中的25-羟基维生素D浓度高度相关。因此，认为母亲在怀孕期间缺乏维生素D会增大子代患精神分裂症的风险[15,18]。2019年，Yazici等[16]讨论了维生素D与精神分裂症之间的关联性以及补充维生素D对治疗精神分裂症的作用，认为虽然现有的观察性研究结论支持维生素D与精神分裂症之间存在潜在联系，但在临床试验中还没有足够高质量的随机对照试验来深入探究维生素D与精神分裂症之间的关联度及其在治疗过程中的有效性和安全性。

影响精神分裂症发生的另一个重要因素就是环境因素，如出生的季节、生活纬度等。人体25(OH)D水平的主要来源是皮肤受紫外线照射后的生物合成。因此，皮肤在阳光下的暴露时间对个体的维生素D水平有显著的影响。调查显示精神分裂症患者中的大多数出生于冬末早春的季节，因为在其产前和围产期时处于较低水平的光照条件下，导致维生素D的缺乏[17-18]。Deluca等[19]发现位于远离赤道纬度的地区的精神分裂症发病率和患病率在逐渐增加。生活在高纬度地区且肤色较深的人更容易患精神分裂症[20]。美国的调查发现黑人育龄妇女患有严重维生素D缺乏症的人数约为白人育龄妇女的10倍[21]。

理解维生素D缺乏对精神分裂症的影响机制，对于探究二者关联性具有重要意义。维生素D作为一种有效的转录调节剂，可以调节脯氨酸脱氢酶的表达。脯氨酸脱氢酶基因位于染色体22q11，此区域是目前已知精神分裂症遗传风险最高的区域。高脯胺酸血症已经被证明与认知能力低下、分裂性情感障碍以及精神分裂症有着密切联系。Clelland等[11]研究发现维生素D不足的人患有高脯胺酸血症的几率是维生素D正常者的3倍。此外，精神分裂症患者通常会患有一些其他代谢类疾病如肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病、高脂血症和心血管疾病等。众所周知，维生素D缺乏与这些代谢问题也有着重要的联系。其生物学机制很可能与维生素D对炎症和免疫过程调节作用有关，从而影响精神分裂症临床症状的表现和治疗反应[22-23]。一些研究者提出利用维生素D调节患者的免疫过程与精神分裂症的治疗反应有一定的关联性。Muller等[24-26]测试了维生素D结合抗炎药物用于治疗精神分裂症患者的效果，研究结果表明抗炎药物“塞来昔布”与抗精神分裂症药物“利培酮”协同作用于急性发作期精神分裂症患者能够显著降低其在精神病理学中PANSS的评分。

为深入探究维生素D与精神分裂症之间的关联性，精准、高效的检测是必不可少的。维生素D在人体中经过一系列酶促反应，最终以生物活性最强的1,25-二羟基维生素D的形式作用于生理活动，然而25-羟基维生素D(25-(OH)D)是维生素D在人体代谢循环中的主要形式，因此常作为评价体内维生素D营养水平的指标[27]。

2 维生素D水平的检测

目前常用的检测方法按照检测原理可分成免疫法和色谱法两大类。其中免疫法主要包括放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光免疫测定法(CLIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)和全自动生化法(ABA)。色谱法主要包括高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。多数文献中25-(OH)D检测所用的生物样本为血清，还有血浆、干血点、唾液、母乳、动物内脏(肝、肾、脾)等其他样本[28]。目前，对于血清中25(OH)D浓度的检测仍存在一定技术挑战，包括：(1) 血液中的维生素D通常与结合蛋白(VDBP)结合，须先将其从结合蛋白上解离；(2) 需利用抗体或重组结合蛋白重新捕获25-羟基维生素D，并排除其它形式的干扰；(3) 需除去样本中VDBP及其它抗体的干扰；(4) 需排除差向异构体的干扰[29]；(5) 检测方法能否达到临床可接受的精密度、敏感度以及线性相关性等参数要求。本文主要介绍一些常用的维生素D的检测方法，各方法的优缺点见表1。

表1 25-羟基维生素D常用检测方法优缺点分析

2.1 25-(OH)D免疫法测定

2.1.1放射免疫法

放射免疫法是利用同位素标记的与未标记的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应的方法的体外微量分析方法。该方法不需要复杂的样品预处理纯化过程，操作简单。目前，RIA试剂盒应用比较广泛、方便，特异性强，是基层单位对超微量物质测定的主要手段。Hollis等[30]于1985年首次把3H-25-(OH)D3作为示踪物，用放射免疫法(RIA)测定25-(OH)D浓度，并于1993年将方法改进，用123I-25-(OH)D3代替了3H-25-(OH)D3作为示踪物[31]，相比于前者，后者改进了示踪物，省略了样品钝化的预处理，操作更加简单，因此也被称为25-羟基维生素D浓度测定最经典的方法。但是放射免疫法存在放射性污染的潜在风险，对实验人员和环境都有一定的危害，放射性废物的处理也比较复杂，而且测量需要设立平行样，试样花费较多，每次检测的数量有限。

2.1.2酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法(ELISA)是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA法在自动化操作、节省人力、无污染等方面具有一定的优势，适合于常规临床实验室开展定量检测。蒋文良用此法测定了10例健康儿童血清25-羟基维生素D的水平[32]。ELISA法的主要缺陷是对基质敏感，容易与其他非目标化合物发生交叉反应，导致方法特异性不足，只能用于检测总的25-羟基维生素D含量。此外，酶促反应易受温度、时间等客观因素影响，导致批内和批间误差相对较大。

2.1.3化学发光免疫测定法

化学发光免疫分析法是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，适用于各种抗原、激素、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。化学发光免疫测定试剂盒使用连接有异鲁米诺衍生物的25-(OH)D，反应终止后加入激发剂，使用光电倍增管检测产生的化学荧光信号。

单咏梅等[33]为确定LIAISON全自动化学发光仪是否可以满足临床检验需求，用其测定25-(OH)D含量。经验证，该方法临床可报告范围为3～262 ng/mL，精密度5.23%，总精密度6.75%，分析灵敏度2.5 ng/mL。符合国家规定的标准，满足临床检测的需要。

化学发光免疫测定法的优点是操作简便，快速检测，无放射性污染，自动化程度高，现已有多家厂商开发出相关自动免疫分析仪。然而，其缺点是自动化仪器价格高且只能用于检测25-(OH)D的总含量。

2.1.4电化学发光免疫测定法

李红等[23]用E-170电化学发光免疫分析仪测定25-羟基维生素D3并与使用酶免检测的数据进行比较，结果显示E-170电化学发光免疫分析仪测定25-羟基维生素D3质控血清检测结果均在1个标准差内；与酶免检测数据比较差异更有统计学意义(P<0.05)，相关性差(r=0.568)。陈益明等[34-35]用ECLIA测定2027名健康婴幼儿(1天～3岁)的血清25-(OH)D含量，初步了解本地区电化学发光免疫分析法检测婴幼儿血清25-(OH)D参考区间，为临床检测维生素D水平缺乏提供科学依据。

2.2 25-(OH)D色谱法测定

2.2.1高效液相色谱法

王剑等[36]用HPLC检测47名正常健康儿童的血清25-(OH)D浓度。结果该方法在10～200 μg/L浓度范围内线性关系良好(r=0.9971)。刘怡欣等[37]用同样的方法测定出健康成年人血清25-(OH)D浓度为(38.14±14.74 μg/L)，25-羟基维生素D在4.00～160.00 μg/L线性范围内与其响应值线性关系良好(r=0.9999)，通过二者的测量结果可以发现高效液相色谱法可用于血清中25-(OH)D的临床检测。

2.2.2液相色谱-串联质谱法

在众多检测方法中，液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)因其极高的特异性、灵敏度和准确性被国际上公认为维生素D水平检测方法的“金标准”[38]。应用与高分离快速液相色谱(RRLC)组合离子源的三重串联四极杆液质联用法可使血清中25-(OH)D2和25-(OH)D3得到快速定量分析[39]。此方法在5～100 ng/mL的浓度范围内具有优异的定量线性度响应(R2>0.99)，且在血清中的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别是2 ng/mL和3 ng/mL[40]。

徐凤仙等[41]采用液相色谱-串联质谱法 (正离子电喷雾离子化(ESI+)的多反应监测模式(MRM))氘代同位素内标法，检测281名志愿者血清中25-(OH)D含量。结果显示，批内精密度为0.88%～7. 69%，批间精密度为1.56%～9.90%；25-(OH)D在5～100 ng/mL范围内线性良好，线性相关系数为0.9999，校准品测试结果准确度为95.5%～101.2%，敏感性高，结果准确、稳定，可应用于临床分析。林海丹等[42]采用同位素内标液相色谱串联质谱法测定婴幼儿食品中维生素D3质量分数。当被测试样质量浓度在2～200 μg/L范围内时，线性相关性较好，相关系数大于0.99。该方法简便、准确，适用于婴幼儿食品中维生素D3的检测。

3 结论与展望

维生素D对维持神经系统功能有着至关重要的作用，对海马体、下丘脑、前额皮质和颞叶的生理功能也有着重要影响[13]。缺乏维生素D将会导致精神分裂症等精神疾病的发病率增加。母亲在怀孕期间缺乏维生素D会增大子代后期患精神分裂症的风险。此外，受出生季节、纬度、光照、肤色等因素影响导致的维生素D缺乏也会使得精神分裂症的患病风险增加。然而，由于维生素D相对其它维生素特殊的合成、代谢方式，对肤色，环境等外界因素的依赖性以及受体基因的多态性，还需要设计更多的前瞻性研究来更为深入地论证二者之间的联系，评估补充维生素D在精神分裂症治疗过程中的作用以及建立更为系统化、多样化的临床试验。

目前，临床上大多采用化学发光免疫分析法检测25-羟基维生素D来评估维生素D的水平。此方法无需萃取、解离以及色谱分析等繁琐的准备工作，并且全自动化学发光平台操作简便、自动化程度高，然而其精确度和灵敏度相对一般。此外，化学发光免疫分析法早期采用的竞争性蛋白结合分析由于会受到内源性维生素D结合蛋白的影响，其灵敏度和特异性远不及近年来得到广泛认可的采用25-羟基维生素D特异性抗体结合法。需要注意的是，各种测定方法都有其各自的优缺点，原理和操作步骤也有所不同，采用不同方法检测25-羟基维生素D结果可能出现不同程度的差异。因此，在方法选择时，应对测定所要求的的灵敏度、特异性、费用、时间及实验人员能力和实验室条件等实际情况进行综合考虑。此外，如何发展更为高效、精准的标准化检测方法还有待进一步研究。