适用热区芒果园的木霉生物有机肥研制及其应用

朱佳芯，商美妮，李 荣，刘红军，乔策策，陶成圆，沈宗专，沈其荣

（南京农业大学资源与环境科学学院，江苏 南京 210095）

芒果是世界五大热带水果之一，也是我国热带主要种植果树之一，已成为我国华南热区农业的支柱产业之一［1］。但我国华南热区土壤淋溶现象强，有机质分解快，导致土壤中有机质含量普遍偏低，随着现代集约化农业的发展而逐渐出现了农作物产量及品质下降等问题［2］。此外，我国热区具有高温多湿、太阳辐射强、降雨不均匀等气候特征，加之芒果园树体遮荫有限，使得芒果园表层土壤温度较高，易损伤根系，影响果树养分的吸收并诱发病虫害的发生，制约了热区芒果产业的高效及绿色发展［3］。

生物有机肥是指特定功能微生物与有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。生物有机肥具有普通商品有机肥的功能特性，如提升土壤有机质、促进土壤养分释放、增加土壤生物肥力等作用，进而促进植物生长，提高作物产量及品质［4］；因其所含的功能菌可在作物根系表面定殖并产生生长素、拮抗物质等次级代谢产物还具有明显地调控土壤微生物区系作用，诱导土壤形成抑制土传病害发生的能力［5］或调节作物代谢而促进生物量的积累［6］。目前有关生物有机肥施用后对热区芒果生物学效应的研究报道较少，更无筛选适用于热区芒果园的功能菌种进而研制其专用生物有机肥的报道。我国热区土壤类型多为红壤、砖红壤等，其pH 普遍偏低且呈酸性，而酸性环境更有利于真菌存活，因此更适合筛选功能真菌菌株进行生物有机肥研制。

木霉是自然界中分布较广泛的一种丝状真菌，主要存在于土壤、腐烂的木材及植物残体中［7］，可通过分泌多种植物生长激素提高土壤养分利用率，增强根际定殖能力等机制来发挥促生作用［8］。然而，木霉的生长易受到环境因子尤其是温度的影响，研究表明28～30℃是木霉菌生长的最适温度［9］，而热区芒果园表层土壤温度较高，因此，有必要从热区土壤中筛选耐热木霉菌株，研制适应热区环境条件的木霉生物有机肥以促进芒果的生长，提高果实的产量和品质。

本实验室从温带气候区域江苏农田土壤中筛选得到的贵州木霉NJAU4742 菌株及用其研制的木霉生物有机肥对黄瓜、辣椒、番茄等作物有良好的促生效果［10］，但其对温度较为敏感，在热区的增产效果存在不确定性。因此，本研究拟从热区土壤中分离筛选适温范围较宽的促生木霉菌株并研制芒果专用生物有机肥，通过盆栽及田间试验验证比较其与用贵州木霉NJAU4742 研制的生物有机肥的促生效果差异，以期为热区芒果园研发出专用生物有机肥，进而为热区农业高效绿色生产提供产品及技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：贵州木霉NJAU4742（Trichoderma guizhouense NJAU4742），由江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室提供。

供试黄瓜品种：供试黄瓜品种为“露丰黄瓜”，购于江苏省农业科学研究院。

供试肥料：供试普通有机肥中有机质含量45%，含氮（N）1.5%、磷（P2O5）2.5%、钾（K2O）1.3%；供试酸解氨基酸由江苏省江阴市联业生物科技有限公司提供，其含16.9%的总氨基酸、10.2%的游离氨基酸，含氮（N）4.6%、磷（P2O5）0.4%、钾（K2O）0.07%；盆栽及田间所用生物有机肥由普通有机肥添加木霉固体菌种掺混制成，其养分含量与普通有机肥一致；供试化肥中氮肥为尿素（N 46.4%），磷肥为过磷酸钙（P2O518%），钾肥为硫酸钾（K2O 52%）。

盆栽供试土壤：盆栽供试土壤为高砂土，采自江苏省如皋市搬经镇，基本理化性质如下：pH 8.2，有机质含量7.1 g/kg，全氮含量0.6 g/kg，全磷含量0.8 g/kg，全钾含量2.4 g/kg，有效磷含量7.8 mg/kg，速效钾含量21 mg/kg。

孟加拉红培养基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g，琼脂20 g，孟加拉红0.03 g，氯霉素0.1 g，蒸馏水1 L，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

木霉选择性培养基：孟加拉红培养基中添加氯霉素0.3 g，链霉素90 mg，五氯硝基苯0.2 g，曲拉通1 mL，于倒平板前加入到三角瓶中。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 自然，115℃高压蒸汽灭菌30 min。

马铃薯葡萄糖培养基（PD）：除不加琼脂外，其他配方与PDA 培养基一致。

1.2 芒果园筛菌用土壤样品的采集

于2017 年10 月从海南省乐东黎族自治县佛罗某芒果园（18°35′38″N，108°43′5″E）采集筛菌用的土壤样品。该果园多为10 年树龄以上的芒果树，随机选定10 棵芒果树，用直径38 mm的土钻在每棵芒果树滴水线附近任意采取1 个0～20 cm的表土土柱，10 棵树的土柱混匀以作筛菌用土壤样品，于4℃下保存备用。

1.3 功能木霉菌株的初筛

称取芒果土壤样品5 g 至载有45 mL 无菌水的100 mL 锥形瓶中，28 ℃、170 r/min 振荡30 min，制成土壤悬液。吸取土壤悬液0.1 mL，涂布于木霉选择性平板上，重复10 个平板，28℃培养2 d，在平板上挑选形态各异的菌落接种于PDA 平板上，纯化3 次以上。在无菌条件下，用直径为5 mm的打孔器在长势一致的木霉PDA 平板上打孔取样，用镊子小心将菌饼移接入新鲜PDA 平板（9 cm）中心，分别放置于35 和40℃培养箱中恒温培养，48 h 后采用十字交叉法测量菌落直径，筛选出能在35 和40℃正常生长且生长较快的木霉菌株。

1.4 初筛木霉菌株的生物有机肥试制

将初筛获取的木霉菌株接种到PD 培养基中，进行液体发酵，发酵温度为28℃，搅拌速度为170 r/min，发酵时间为96 h，得到木霉发酵液。经镜检，每毫升发酵液中木霉孢子数大于1×107个。将100 g 秸秆（干重）和200 mL 水混合并加入6.6 mL 酸解氨基酸，拌匀后115℃灭菌1 h。灭菌冷却后，接入20 mL 上述制备好的木霉发酵液，28℃培养7 d，以浅盘法［11］发酵制得木霉固体发酵物，放于4℃冰箱保存。经镜检，每克（干重）固体木霉菌种中含木霉孢子数为5×109个。将木霉固体发酵物按10%（w/w）的比例掺混于普通有机肥中，制成木霉生物有机肥。

1.5 功能木霉菌株的室内盆栽复筛实验设计

于2018 年7～8 月 及9～10 月在江苏省宜兴中宜生物肥料工程中心温室分别开展两季盆栽试验，筛选促生效果最优的木霉生物有机肥产品，每季盆栽试验设置以下4 个处理：1）不施肥对照（CK）；2）化肥处理（CF），只施化肥；3）普通有机肥处理（OF），施用普通有机肥；4）木霉生物有机肥处理（T-BIO），只施木霉生物有机肥。各处理等养分设置，用化肥补齐养分，具体施肥信息见表1。每个处理共6 盆，每盆装土1.6 kg，于装土前将所需有机肥及化肥一次性施入并与土拌匀后装盆备用。每盆移栽一棵长势均一的两叶一心的健康黄瓜苗，正常管理。在30 d 时测定各个处理的黄瓜植株的地上部鲜重和干重。

表1 不同处理的施肥用量 （g/盆）

1.6 盆栽土壤样品采集和指标测定方法

试验于黄瓜的初花期（30 d）测定黄瓜植株地上部鲜重和干重，用剪刀将其地上部与地下部分离，植株装进信封并称其鲜重，放置烘箱内，105℃杀青30 min，75℃烘干至恒重。每季黄瓜收获时，各处理随机选择3 株健康黄瓜，轻轻抖落附着在根系表面的土壤，装入无菌自封袋，放于4℃冰箱储存。土壤中木霉属数量的测定采用平板稀释涂布计数法，称取5 g 样品溶于45 mL 无菌水中，振荡30 min 保证样品与无菌水混合均匀后进行梯度稀释，涂布于木霉选择性培养基平板上，28℃培养48 h 后计数。

1.7 田间试验设计

田间试验于2018 年9 月至2019 年6 月在海南省乐东黎族自治县佛罗某芒果园（18°35′38″N，108°43′5″E）进行。供试芒果园树龄为10 年，长势相似。果园土壤是砂壤土，基本土壤理化性状如下：pH 6.24，有机质含量6.31 g/kg，全氮含量0.09 g/kg，有效磷含量15.38 mg/kg，速效钾含量78.11 mg/kg。于2018 年9 月，上一茬芒果收获后施入基肥，本试验共设计4 个处理：1）不施肥对照（CK）；2）化肥处理（CF），只施化肥；3）普通有机肥处理（OF），施用8 kg 普通有机肥；4）木霉生物有机肥处理（T-BIO），施用8 kg 木霉生物有机肥。各处理等养分设置，用化肥补齐基肥养分差（表2）。每个处理选择6 棵芒果树进行肥料试验，除不施肥对照不施入任何肥料外，其他处理的追肥及其他农事操作与果园日常操作一致。于2019 年6 月芒果收获期进行产量及品质测定。

表2 不同处理的基肥施用量 （kg/棵）

1.8 田间土壤样品采集和指标测定方法

在芒果收获期，在每棵芒果树滴水线附近随机采取1 个0～20 cm的表土土柱，每个处理每2 棵树的土柱混匀组成一个样品保存，经风干磨细过筛后，测定其基本理化性质。待果园整体成熟度达到采收要求时，将各处理每棵树上所有果实采摘后单独计重，即为所有果实重量；将其中重量大于100 g的芒果挑选出来分别称重，即为商品大果重。每个处理分别从每棵树上随机挑取2 个商品大果，切取其中间部位，测定果实中的可溶性固形物、维生素C 和可溶性糖含量。可溶性固形物含量的测定参照张劲等［12］的方法，维生素C 含量的测定采用高效液相色谱法［13］，可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法［14］。土壤理化性质测定参照土壤农化分析［15］。

1.9 功能木霉菌株的鉴定

采用ITS 及TEF 分子标记鉴定筛选所得促生效果最优的木霉生物有机肥产品中的木霉菌株的分类信息。将该功能菌株接种于新鲜PDA 培养基上，28℃培养3 d 后刮取木霉菌丝体，利用OMEGA 真菌DNA 提取试剂盒提取DNA。用ITS 和tef1 引物扩增菌株ITS 及tef 基因片段进行分子鉴定。ITS 扩增引物分别为ITS1：5’-AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG-3’和ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’；tef 扩增引物为：EF1H：5’-ATG GGT AAG GAA GAC AAG AC-3’和EF2T：5’-GGA AGT ACC AGT GAT CAT GTT-3’。扩增条件参照原始文献［16］，扩增产物送由南京擎科生物科技有限公司测序。将测序所得ITS 及tef 基因序列与GenBank 数据库进行Blast 比对分析，获取分类信息。

1.10 数据处理

采用Excel 2007 和SPSS 22.0 软件进行数据统计分析，使用单因素方法分析（ANOVA）进行数据比较，最小显著差异法（LSD）检验进行多重比较（P＜0.05）。采用Mr Bayes v3.2.6 构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 功能木霉菌株的初筛结果

从海南芒果土壤中初步筛选出木霉候选菌株15株，结合不同温度条件下的生长速度，进一步筛选获得4 株木霉菌株（MD8、MD30、JS11、LI2C），其在35 和40℃均能生长。其中，在35℃下，菌株MD30、JS11、LI2C 生长48 h 后完全长满平板，菌落直径达8.5 cm；而在40℃下，仅菌株MD30 和LI2C 生长48 h 后完全长满平板，菌落直径达8.5 cm（图1）。2.2 室内条件下功能木霉菌株的复筛结果

2.2.1 木霉生物有机肥施用对黄瓜生物量的影响

将可在40℃下生长的菌株MD8、MD30、JS11、LI2C 和NJAU4742 制作成木霉生物有机肥进行盆栽试验。第1 季盆栽试验结果表明，4742 和MD30木霉生物有机肥处理黄瓜地上部鲜重和干重均显著高于不施肥对照（CK）、化肥处理（CF）、有机肥处理（OF）和MD8、JS11、LI2C 木霉生物有机肥处理（图2A）。MD30 处理的黄瓜鲜重和干重较CK 处理分别增加了29%和64%；与CF 处理相比，分别增加了19%和31%；与OF 处理相比，分别增加了15%和26%。第2 季盆栽试验结果表明，4742 和MD30 木霉生物有机肥处理对黄瓜苗期的促生效果仍显著，其中MD30 处理地上部鲜重和干重相比于CK 处理，分别增加了116%和53%；相比于CF 处理，分别增加了28%和22%；相比于OF 处理，分别增加了15%和11%（图2B）。

2.2.2 木霉生物有机肥施用对黄瓜土壤木霉属数量的影响

由图3 可知，两季盆栽试验中施用木霉生物有机肥处理能增加土壤中可培养木霉属的数量，MD30 和4742 木霉生物有机肥处理土壤中木霉属数量均达到5×104cfu/g 以上，显著高于其他处理，但MD30 与4742 处理间无显著差异。

2.3 功能木霉菌株的鉴定

由图4 可知，菌株MD30 在PDA 平板上生长较快，绒毛状白色菌丝，大量产生绿色孢子，有白色杂质，形成同心轮纹，新鲜菌株背面产生黄绿色可扩散性色素。

根据ITS 序列构建的系统发育树（图5A）分析表明，菌株MD30 属于肉座菌目肉座菌科木霉属真菌，根据tef1 序列构建的系统发育树（图5B）表明，MD30 位于T.longibrachiatum 分支上，与模式菌株T.longibrachiatum ATCC 18648 相近，进一步结合菌株的形态特征，将MD30 鉴定为T.longibrachiatum 长枝木霉。

2.4 田间条件下木霉生物有机肥对芒果生产的生物学效应

2.4.1 木霉生物有机肥施用对芒果产量的影响

据盆栽试验效果，选择菌株MD30 研制成生物有机肥并进行田间试验。由图6 可知，MD30 处理的产量显著高于不施肥处理（CK）、化肥处理（CF）、有机肥处理（OF）和NJAU4742 木霉生物有机肥处理（4742），分别增产13%、7%、6%和3%。MD30 处理的单果重和商品大果重均显著高于CK、CF、OF 和4742 处理，MD30 处理单果重分别比CK、CF、OF 和4742 处理增加43%、37%、40%和25%；商品大果重分别增加63%、27%、33%和22%。结果表明施用木霉MD30 生物有机肥能提高芒果果重，达到增产的效果。

2.4.2 木霉生物有机肥施用对芒果果实品质的影响

由图7 可知，MD30 处理显著提高了芒果果实中可溶性固形物和还原糖的含量，减少了维生素C 含量。与CK、CF、OF 和4742 处理相比，MD30 处 理的可溶性固形物含量分别增加了13%、10%、9%和7%；还原糖含量分别增加了21%、20%、13%和6%。

2.4.3 木霉生物有机肥施用对芒果土壤理化性质的影响

由表3 可知，MD30 处理相比CK、CF、OF 和4742 处理，土壤全磷和有效磷含量存在显著性差异；MD30 处理的有机质含量、全磷、全钾、有效磷和速效钾含量显著高于CK 处理。各处理中土壤pH 和全氮含量差异不显著。

表3 不同施肥处理对土壤理化性质的影响

3 结论与讨论

木霉生物有机肥能够有效补充作物生长所需营养元素，促进植物生长，是提高农作物产量和品质的重要途径［17］。本研究首先从海南芒果根围土土壤中分离木霉菌株，经过35 和40℃条件下测量菌丝生长直径初步筛选得到了4 株耐热木霉菌株，其中菌株MD30 能在35 和40℃下正常生长且48 h 后菌落直径最大，表明该菌株具有一定的耐热性。

将筛选出的菌株研制成木霉生物有机肥并通过盆栽试验复筛，验证其促生效应。虽然两季盆栽种植时气温有明显差异，导致两季生物量差异较大，但两季盆栽试验结果均表明，施用MD30 木霉生物有机肥对黄瓜生物量的促进作用最为显著。杨春林等［18］研究发现，木霉生物有机肥对黄瓜、白菜、辣椒和菠菜等多种蔬菜的生长有较强地促进作用。此外，李瑞霞等［10］研究证明，施用含菌株NJAU4742的生物有机肥能够有效促进番茄生长，提高肥料利用率。相比于CK、CF 和OF 处理，木霉生物有机肥处理的盆栽土壤木霉菌数量显著提升。生物有机肥具有活化土壤养分、促进植物生长、环境友好等特性［19-20］，研究表明功能菌有效活菌数是生物有机肥在促进作物生长方面的关键因素［21］。因此，推断是由于生物有机肥中含有大量木霉功能菌，从而促进植物生长。MD30 与4742 处理相比，促生效果没有显著性差异，这可能是由于宜兴的环境温度处于木霉生长适应温度，体现不出菌株MD30 适温范围宽的特性。

与钟川等［22］对芒果研究、邹荣松等［23］对草莓研究、秦光齐等［24］对马铃薯研究结果一致，将MD30 生物有机肥施用于海南芒果大田试验中，MD30 处理显著提高了芒果产量，有效改善了果实品质。Molla 等［25］发现施用木霉生物有机肥可以显著提升番茄果实的可溶性固形物、糖分及其他指标，与本研究结果相似。土壤有机质是土壤肥力水平的主要指标，提高土壤有机质有助于芒果产量的提高。MD30 和4742 处理显著提高了芒果大田土壤有机质、有效磷和速效钾的含量，提高了土壤肥力，这可能是木霉菌在生命活动周期中产生大量有机酸，使土壤中速效的氮、磷、钾等营养得到释放，供植物生长［26］。赵政等［27］发现减量化肥配施NJAU4742 木霉生物有机肥不仅能保证番茄稳产，还能显著提升番茄果实品质，活化土壤养分，改变土壤微生物群落结构，从而改善土壤肥力状况，这与本试验研究结果一致。MD30 和4742 处理均能提高芒果的产量和品质，但MD30 处理的效果最佳，可能是因为海南地区土温较高，更适合于适温范围宽的菌株MD30 生存及发挥作用。

综上所述，菌株NJAU4742 和MD30 均有促生效果，但是菌株MD30 更能适应热区环境条件，促生效果更佳。本试验分离筛选获得一株能在40℃高温生长的促生木霉菌株MD30，经鉴定为长枝木霉菌（T.longibrachiatum），开发出了适用于热区芒果园的专用生物有机肥，为热区果树的减肥减药提供了技术支持与理论依据。