呕吐毒素荧光定量快速检测试纸卡及仪器技术性能优化的研究报告*

巩性涛 ，王 培 ，肖理文 ，宋永泉 ，徐 秀 ，赵 皖 ，王春霞

（1.山东省粮油检测中心，济南 250101；2.南京微测生物科技有限公司，南京 210000；3.山东省中储粮粮油质监中心有限公司，济南 250199）

呕吐毒素主体成分为DON（deoxynivalenol,脱氧雪腐镰刀菌烯醇），属于单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、粉红镰刀菌、雪腐镰刀菌等镰刀菌产生。另外，头孢菌属、漆班菌属、木霉属等菌株都可产生该毒素。单端孢霉烯族毒素共有150多种，是一类强有力免疫抑制剂，其引起的典型症状是动物采食量降低，所以这类毒素又叫饲料拒食毒素。呕吐毒素（DON）是其中最重要的一种毒素，主要来自镰刀菌属（Fusarium），尤其是禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）和黄色镰刀菌（Fusariumculmorum）。由于它可引起猪的呕吐，故又名呕吐毒素（Vomitoxin，VT）[1-2]。

呕吐毒素是食品中常见的真菌毒素，在自然界中广泛存在，在欧洲及北美常见的3种毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇。在中国2018年白奥明原料与饲料霉菌毒素检测报告显示：玉米中呕吐毒素是15-乙酰呕吐毒素（被定义为霉菌毒素）出现最多，小麦中3-乙酰基呕吐毒素、15-乙酰基呕吐毒素、雪腐镰刀菌烯醇出现频率都很高。不管哪种类型呕吐毒素都具有很高的细胞毒素及免疫抑制性质，会对人类及动物的健康构成威胁，特别是会对免疫功能造成明显的影响。

根据DON的剂量和暴露时间的不同可引起免疫抑制或免疫刺激，当人摄入了被DON污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳及反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统而造成死亡。呕吐毒素DON对于粮谷类的污染状况与产毒菌株、温度、湿度、通风、日照等因素有关，小麦赤霉病主要分布在潮湿的温带地区，中国小麦大部分产区恰恰处于这一地带，这是中国呕吐毒素污染较严重的原因之一，多雨年份尤其在收粮前多雨会导致DON污染状况更严重，如2018年河南、江苏、安徽、山东部分地区发生大面积呕吐毒素污染。1998年在国际癌症研究机构公布的评价报告中，呕吐毒素被列为3类致癌物；各国也制定了严格限量标准，欧盟要求粮食谷物及其制品中呕吐毒素最高限量要小于1.0 mg/kg；GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中要求粮食谷物及其制品中呕吐毒素的含量低于1.0 mg/kg，GB 13078.3-2017《饲料卫生标准》中规定了配合饲料中呕吐毒素的限量低于 1.0～5.0 mg/kg 不等[3-5]。

目前，国标法测定呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物）采用HPLC法，此方法需要大型的仪器设备，设备价格昂贵，操作过程复杂、时间较长，且无法在现场和基层小型实验室使用。也有采用呕吐毒素酶联免疫试剂盒或胶体金快速检测试纸卡等方法，此方法用于大量样品的筛查，具有操作简便，检测快速，成本较低等优点，但准确性和重复性较差，容易造成假阳性或者假阴性。因此，针对快速检测试纸卡存在的不足，山东省粮油检测中心与南京微测生物科技有限公司对基于荧光定量免疫层析平台的呕吐毒素荧光定量快速检测试纸卡进行了产品的优化升级，使之操作简单快速、准确性和重复性较高，且使用成本较进口同类产品成本降低30%左右，能更好满足不同客户的日常检测需求，确保粮食和食品安全[6-7]。

1 试剂、材料、仪器和方法

1.1 试剂和材料

除注明外，试剂均为分析纯，试验用水均为国标一级蒸馏水。

呕吐毒素荧光定量快速检测试纸卡由乳胶垫、NC膜、样品垫及吸收垫组成，乳胶垫上包裹有荧光微球标记呕吐毒素DON抗体；NC膜上喷涂有呕吐霉毒素DON抗原检测线和喷涂有羊抗兔二抗控制线。样品提取液、样品稀释液、标准曲线ID卡及标准曲线条形码均由上海飞测生物科技有限公司提供。

呕吐毒素的标准品：购自Sigma公司；大米、玉米、小麦及面粉等样品从超市购得或从企业取样；麸皮，小麦、面粉等饲料样品从饲料厂、面粉加工厂和小麦收储企业取样。

1.2 仪器与设备

FD-600型荧光免疫定量分析仪和FD-2000型试纸卡恒温孵育器，由上海飞测生物科技有限公司提供生产；低速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；漩涡混匀器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；电子天平：Sartorius赛多利斯公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的前处理

取具有代表性的待测样品500 g，用粉碎机粉碎1 min后过20目筛，收集过筛后的均匀细小样品。称取过筛后的样品5.0±0.02 g于50 mL离心管中，加入25 mL提取液，用漩涡混匀器振荡3 min(或者摇床振荡3 min）后，4 000 r/min离心2 min，取上清液。

1.3.2 检测过程

100 μL离心上清液加入1 000 μL样品稀释液中，用漩涡混匀器混匀3～5 s，然后取 100 μL待测液加入到呕吐毒素荧光定量试纸卡的加样孔中，置于37℃恒温孵育器中孵育8 min，8 min后将试纸卡插入荧光定量免疫分析仪中读数，读数值即为样品的实际检测浓度。当检测值大于5 000 μg/kg时，可用提取液将离心上清液稀释5倍后再按照后续步骤进行检测，所得读数值乘以5即为样本最终的检测浓度。

1.3.3 试纸卡原理

将待测样品滴加在试纸卡加样区时，样品中的呕吐毒素与结合垫中荧光微球标记的呕吐毒素抗体结合并通过毛细作用向前层析，到达检测区后，检测线T线上固定的呕吐毒素抗原与剩余未结合的荧光微球标记呕吐毒素抗体结合。检测线T线上结合的荧光微球标记抗体的量与样品中待测物的量成反比，质控线C线结合的荧光标记物与样品中待测物的量无关，剩余或其它荧光标记物继续层析达到吸收区。反应结束后，使用荧光定量免疫分析仪读取T线和C线的荧光强度并计算T/C值，通过仪器内置的标准曲线即可计算出样品中呕吐毒素的含量。

1.3.4 试纸卡优化

在单T线的基础上，增加一条矫正T线，形成质控线C线一条、检测线T线两条的方式。

2 检测结果分析

2.1 呕吐毒素试纸卡检测线数量由两线优化成三线的实验

选用国标法测定呕吐毒素浓度值为空白的样本中分别添加呕吐毒素的浓度为 100、250、500、1000、2 500、5 000 μg/kg，然后按照呕吐毒素试纸卡检测方法同时进行两线及三线试纸卡检测，每个加标样本各检测2个平行样，对比试纸卡的灵敏度，检测结果见表1；选取高中低3个加标浓度点，每个加标样本检测6个平行样，对比试纸卡的重复性 ，检测结果见表2。

从表1可知，呕吐毒素三线试纸卡的100 μg/kg检测灵敏度为34.79%；两线试纸卡的100 μg/kg检测灵敏度为23.32%；从单一100 μg/kg浓度点检测灵敏度对比，三线试纸卡灵敏度更高；且综合对比不同浓度点的检测灵敏度，也得出呕吐毒素三线试纸卡灵敏度较两线试纸卡更高。

表1 呕吐毒素两线与三线试纸卡的灵敏度 浓度单位：μg/kg

从表2可知，筛选高中低三个浓度点进行重复性检测，呕吐毒素三线试纸卡检测变异系数CV范围为4.36%～9.60%；两线试纸卡检测变异系数CV范围为5.55%～12.69%；对比三线试纸卡与两线试纸卡的检测变异系数CV范围，三线试纸卡检测变异系数CV更小，重复性更高。

表2 呕吐毒素两线与三线试纸卡的重复性 浓度单位：μg/kg

综合呕吐毒素三线试纸卡与两线试纸卡的灵敏度与重复性对比，呕吐毒素三线试纸卡比两线试纸卡灵敏度、重复性更高。

2.2 检测线数量为三线的呕吐毒素试纸卡性能检测

2.2.1 呕吐毒素试纸卡的检出限及定量限实验结果

选用国标法测定呕吐毒素浓度值为空白的样本20份，然后按照呕吐毒素试纸卡检测方法进行检测，每个样本检测1个试纸卡。检测结果见表3。

由表3中检测数据分析可知：呕吐毒素试纸卡的检出限为 27.543 μg/kg；定量限为 65.676 μg/kg。

表3 呕吐毒素试纸卡的检出限及定量限 浓度单位：μg/kg

2.2.2 呕吐毒素试纸卡的检测范围的实验结果

选用国标法测定呕吐毒素浓度值为空白的样本中分别添加呕吐毒素的浓度为 100、250、500、1000、2500、5 000 μg/kg，然后按照呕吐毒素试纸卡检测方法进行检测，每个加标样本各检测2个平行样。检测结果见表4。

通过表4的检测数据可知，在空白样本中添加呕吐毒素的浓度为100 μg/kg时，检测灵敏度为33.84%，与空白样本检测存在梯度差；阴性样本加标浓度从100～5 000 μg/kg时，检测灵敏度范围为33.84%～94.61，且不同浓度点检测抑制率分散率较好，因此呕吐毒素可定量检测的范围为100～5 000 μg/kg。

表4 呕吐毒素试纸卡的检测范围 浓度单位：μg/kg

2.2.3 呕吐毒素试纸卡的准确度和重复性实验结果

选用国标法测定呕吐毒素浓度值为空白的样本中分别添加呕吐毒素浓度为 100、250、500、1 000、2500、5 000 μg/kg，然后按照呕吐毒素荧光定量试纸卡的检测方法进行检测，每个加标样本各检测3个平行样。检测结果见表5。

通过表5可知，大米样本的加标回收率为88.83%～117.70%；玉米样本的加标回收率为86.50%～120.68%；小麦样本的加标回收率为87.08%～111.28%；综合三种不同基质样本加标检测回收率范围为86.50%～120.68%，说明样本加标检测回收率高，呕吐毒素试纸卡检测准确度较高；

表5 呕吐毒素试纸卡的准确度和重复性 浓度单位：μg/kg

大米样本的变异系数CV范围为4.00%～10.10%；玉米样本的重变异系数CV范围为1.59%～12.64%，小麦样本的变异系数CV范围为5.51%～11.99%；综合三种不同基质样本加标检测变异系数CV范围为1.59%～12.648%，说明呕吐毒素试纸卡整体变异系数CV较小，试纸卡重复性较好。

2.2.4 呕吐毒素试纸卡的稳定性的实验结果

将呕吐毒素检测样本放在2～10℃环境下保存，并在每个月固定日期进行样本检测，筛选固定不同基质已知不同浓度值样本（德国拜发质控物）用于试纸卡稳定性检测，每个样本检测1个试纸卡，检测结果见表6。

通过表6数据可知，呕吐毒素试纸卡在2～10℃保存8个月，不同基质样本检测偏差范围为-7.66%～10.97%，说明呕吐毒素试纸卡在2～10℃温度8个月的保存整体偏差在±11%以内，说明产品的稳定性较好。

表6 呕吐毒素试纸卡的稳定性 浓度单位：μg/kg

2.3 设备与产品优化后进行玉米粉中呕吐毒素不同单位验证检测

验证单位1：山东省粮油检测中心；验证单位2：中储粮山东分公司质检中心实验室；验证单位3：江苏省粮油质量监测中心。

通过表7～表15的计算分析可知，三家验证单位检测结果平均值也符合国家标准适用性要求，说明设备与产品稳定性较好。

表7 检出限与定量限 （单位：μg/kg）：玉米基质

表8 浓度水平1准确性结果 （单位：μg/kg）：玉米基质

表9 浓度水平2准确性结果 （单位：μg/kg）：玉米基质

表10 浓度水平3准确性结果 （单位：μg/kg）：玉米基质

表11 浓度水平1台间差结果 （单位：μg/kg）：玉米基质

表12 浓度水平2台间差结果 （单位：μg/kg）：玉米基质

表13 浓度水平3台间差结果 （单位：μg/kg）：玉米基质

表14 浓度水平2重复性结果 （单位：μg/kg）：玉米基质

表15 仪器性稳定结果 单位：μg/kg

2.4 优化试纸卡与其它产品检测对比

通过表16中优化产品同国外知名品牌产品对同一样本检测数据对比，优化产品回收率为99.50%，国外知名品牌产品回收率为82.27%；优化产品变异系数CV为3.21%，国外知名品牌产品回收率为13.07%，从样本值检测回收率与变异系数CV数据分析，优化产品检测效果优于进口产品，说明可以替代进口产品。

表16 优化产品与进口产品脱氧雪腐镰刀菌稀醇质控品检测结果 单位：μg/kg

3 结论

从呕吐毒素荧光定量试纸卡三线与两线的灵敏度、不同浓度点梯度与重复性等的检测数据对比可知，三线试纸卡灵敏度更高；不同浓度点分布更合理，且三线试纸卡检测变异系数CV范围更小，重复性更高。通过对三线试纸卡检测限、检测范围、不同基质样本重复、稳定性等检测验证实验可知，优化后三线试纸卡的准确度、重复性、稳定性等均达到更优的效果，更能满足快速定量检测需求。另外荧光定量免疫分析仪根据仪器稳定性要求检测鉴定结果可知，仪器稳定性好且两台设备的测定结果之间不存在显著性差异，完全可以替代同类型进口仪器。

从产品性能上综合评价，普通免疫层析快检产品通常采用单检测线（T线）定量方法，虽然产品研发周期短，生产工艺简单，成本也低，但检测结果的精密度难以控制，导致结果的重复性较差。呕吐毒素荧光定量快速检测试纸卡在单T线的基础上，增加一条矫正T线，与质控线（C线）一起，形成“双保险”，大大提升了检测结果准确度、精密度和重复性。