基于网络药理学探讨4-乙酰氧基苯并噁唑-2-酮对急性肝损伤的作用机制*

张 华，周焕芳，梁英琴，徐万鹏，孙雪梅，陆俊霏，覃 思，林 军△

（1.广西医科大学药学院，南宁 530021；2.广西医科大学第十附属医院，钦州 535000 ；3广西医科大学附属肿瘤医院药学部，南宁 530021）

肝脏是人类最重要的器官之一，各种肝损害引起的肝炎是一个世界性的健康问题。急性肝损伤（ALI）是指突然出现大量肝细胞坏死或肝功能显著异常的综合征，以凝血机制障碍、黄疸及肝性脑病等症状为主要表现，可累及机体多个系统[1]。该病起病急，病情危重，肝细胞广泛坏死，且目前缺乏有效治疗手段，治疗药物的干预效果较差，病死率较高[2]。

中国传统药物在治疗肝损伤中发挥着重要作用。老鼠簕(Acanthus ilicifolius L.)属爵床科(Acanthaceae)老鼠簕属(Acanthus)，是一种重要的药用红树林植物，民间主要用于治疗淋巴结肿大、急慢性肝炎、肝脾肿大、胃痛、咳嗽、哮喘，外敷用来治疗瘰疬。本课题组前期研究发现，老鼠簕提取物中的单体活性成分为老鼠簕生物碱A，其化学名为4-苯并噁唑-2-酮（HBOA），具有良好的抗炎、抗氧化活性[3]，但由于老鼠簕植物生长缓慢，限制了从中大量的提取，经广西医科大学药学院药物化学教研室的探索，现已能够实现全人工合成，并且进一步合成了一系列低毒的HBOA 衍生物[4]，4-乙酰氧基苯并噁唑-2-酮（AcO-BOA）为衍生物之一，根据前期研究结果，AcO-BOA 具有良好的抗炎和保肝作用[5]，但其具体作用机制尚不明确。

网络药理学作为药理学新兴分支学科，给中医药的发展带来了新的思路和方法[6]。本研究旨在运用网络药理学方法预测并筛选AcO-BOA 和ALI 的交集靶点，进行富集并分析其所参与的生物过程及信号通路，从而探讨AcO-BOA 防治ALI 的潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 数据库 所用数据库包括Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）、Phammapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、Gene-Cards 5.0（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）、String 11.0（https://stringdb.org/）、David 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）、Omicshare 5.0.1（https://www.omicshare.com/tools/）、Uniprot（https://www.uniprot.org/）、RCSB PDB（https://www.rcsb.org/）。

1.2 主要材料与试剂 SPF 级健康C57 小鼠，体重（18±22）g，购于广西医科大学实验动物中心，动物使用许可证号：SCXK(桂)2020-0003。AcOBOA，广西医科大学药学院药物化学教研室合成，纯度＞90%。脂多糖（LPS，北京索莱宝科技有限公司，批号：426Y034）；D-氨基半乳糖（D-GalN，合肥博美生物科技有限责任公司，批号：RT052019）。一抗AKT、β-actin（中国Proteintech 公司）；p-AKT（美国Affinity公司）。

1.3 药物靶点、疾病靶点、药物与疾病交集靶点的筛选 采用ChemDraw 软件绘制AcO-BOA 的结构式，分别导入Swiss Target Prediction 及Phammapper数据库，获取药物相关靶点。登陆GeneCards 5.0和OMIM数据库，分别以“Acute Liver Injury”，“Hepatic Injury”作为关键词进行检索，从而获取ALI 相关靶点。登陆Venny 2.1.0网站，分别输入药物和疾病的靶点，即可获得AcO-BOA和ALI的交集靶点。

1.4 蛋白质相互作用（PPI）网络的构建及核心靶点的筛选 登陆String11.0 在线网站，输入AcO-BOA和ALI的交集靶点，物种选择为“Homo sapiens”，设置隐藏游离靶点，得到PPI 网络。将PPI 网络图.tsv格式文件导入Cytoscape 3.7.1 软件进行拓扑分析并获得各节点的中心度值（Degree），根据Degree 值大小将PPI 网络图可视化。利用Cytohubba 插件计算并筛选出网络中Top 10的核心靶点。

1.5 基因功能和通路富集分析及“成分－靶点－通路”网络图的构建 将所获得的Top 10核心靶点输入David 6.8数据库，物种选择为“Homo sapiens”，选择“office gene”，以P＜0.05 为阈值，筛选出Top 20的生物过程和信号通路。再运用Omicshare5.0.1在线工具绘制动态富集气泡图。最后运用Cytoscape 3.7.1 软件，构建AcO-BOA 与Top 10 核心靶点及Top 20信号通路的“成分－靶点－通路”网络图。

1.6 分子对接验证 配体分子的准备：将配体分子（即AcO-BOA）结构式，保存为mol2 格式。受体分子的准备：登陆Uniprot 数据库获取受体分子的ID号，在PDB 数据库下载各受体的3D 结构，采用Pymol 软件处理后另存为.pdb 格式。运用AutoDock-Tools-1.5.6 软件对其进行加氢，计算电荷，设置原子类型处理后，另存为.pdbpt格式。对接：根据受体分子的活性位点，设置对接范围和计算方法，运用软件开始对接，运用Pymol软件对结果进行分析。

1.7 实验动物分组及给药 AcO-BOA 用CMC-Na作为溶剂，D-GalN 和LPS 均用生理盐水作为溶剂。将C57 小鼠随机分为5 组：正常组、模型组及AcOBOA低剂量（50 mg/kg）、中剂量（100 mg/kg）和高剂量（200 mg/kg）组，每组8只。给药组按20 mL/kg灌胃相应剂量的AcO-BOA，正常组和模型组灌胃等量CMC-Na，连续10 d。末次给药后禁食不禁水12 h，除正常组（注射等量生理盐水）外，其它各组均腹腔注射D-GalN（800 mg/kg）/LPS（40 µL/kg）复制ALI小鼠模型。

1.8 血清碱性磷酸酶（ALP）含量检测 造模4 h后，将小鼠麻醉后眼球取血，血液静置1 h 后离心，取上层血清，用全自动生化仪检测各组小鼠血清中ALP的含量。

1.9 Western blotting法检测肝组织AKT、p-AKT蛋白表达 取肝组织，称重后在预冷的研钵中用液氮研磨，加入裂解液，冰上裂解20 min，离心，取上清，加入蛋白上样缓冲液，混匀，煮沸使蛋白变性，使用SDS-PAGE分离蛋白，转移至PVDF膜，封闭1 h后；将膜转移至一抗β-actin(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)，4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜3次；荧光二抗室温下避光孵育1 h，洗膜；用双色红外激光成像系统（美国Odyssey LI-COR 公司）扫膜，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.10 统计学方法 采用SPSS 17.0 软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差（）表示，各组间均数的比较采用单因素方差分析，方差齐时，两两比较采用LSD-t检验；方差不齐时，采用Tamhane’sT2检验；以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 药物靶点的筛选 根据Swiss Target Prediction及Phammapper 数据库的筛选并处理后，共获得药物靶点268 个。AcO-BOA 结构式见图1，其分子量＜200，药代动力学性质(Pharmacokinetics)中胃肠道吸收系数为高，表明AcO-BOA在胃肠道易吸收；类药性(Druglikeness)中前5个性质中有4个满足条件，符合类药五原则，表明AcO-BOA 在生物体内代谢过程中有较高的生物利用度，更有潜力成为口服药物。

图1 AcO-BOA结构式

2.2 疾病靶点筛选结果 分别从GeneCards、OMIM 数据库筛选出ALI 相关靶点1 906 个和291个，对靶点进行合并，删除78 个重复值后，共获得ALI相关靶点2 119个。

2.3 药物与疾病交集靶点的筛选 分别将268 个药物靶点和2 119 个疾病靶点导入Venny 2.1.0 网站绘制韦恩图（图2），即获得AcO-BOA防治ALI的潜在靶点，共52个，见表1。

图2 靶点韦恩图

表1 AcO-BOA对ALI的保护作用的潜在靶点

2.4 PPI 网络的构建及核心靶点的筛选 Cytoscape 3.7.1 软件所绘制的PPI网络图如图3A所示。图中各节点(Node)表示蛋白，连线(Edge)表示蛋白之间的关联。各节点大小和颜色与其Degree 值呈正相关，Degree 值越大，节点面积越大，颜色越深。Cytohubba 插件筛选出的Top 10 核心靶点，如图3B所示。颜色越深，说明该节点越重要。Top 10 核心靶点为丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT1)、表皮生长因子受 体(EGFR)、Toll 样 受 体4(TLR4)、酪 氨 酸 激 酶(SRC)、Toll 样受体9(TLR9)、酪氨酸激酶(JAK1)、淋巴细胞特异性酪氨酸激酶(LCK)、β 淀粉样前体蛋白(APP)、细胞周期检测点激酶1(CHEK1)和E1A结合蛋白EP300(EP300)，见表2。以上结果提示AKT1在该网络中的作用更为重要。

表2 前10核心靶点信息

图3 PPI网络的可视化图及核心靶点图

2.5 基因功能和通路富集分析及“成分－靶点－通路”网络的构建 GO 分析包括生物学过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)。GO 分析共富集到111 条生物学过程，其中所涉及BP 为77 条，CC 为14 条，MF 为20 条。KEGG 通路富集分析共涉及38条信号通路。运用Omicshare 在线工具，均按照富集基因数目筛选出Top 20 富集结果，以P＜0.05 为阈值，绘制动态富集气泡图。

GO 分析结果显示，Top 20 条生物学过程主要包括先天免疫反应（innate immune response）、细胞对机械刺激的反应（cellular response to mechanical stimulus）、调节细胞增殖（regulation of cell proliferation）等；KEGG通路富集结果显示，Top 20信号通路中主要包括PI3K-AKT信号传导途径（PI3K-Akt signaling pathway）、癌症途径（pathways in cancer）、Toll 样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）等。“成分—靶点—通路”网络有1 个AcOBOA 节点，10 个基因节点，20 个信号通路节点，共形成64 条连线，根据Degree 值由小到大顺时针分布，节点面积越大，说明该节点越重要。可见靶点中AKT1 及通路中PI3K-AKT通路在该网络中发挥重要作用，见图4。提示AKT1及PI3K-AKT通路在AcO-BOA防治ALI中具有重要意义。

图4 富集分析气泡图和网络图

2.6 分子对接验证结果 将AcO-BOA 与筛选出的Top 10 靶点进行分子对接验证。对接结果与结合能大小相关，结合能是指配体和受体分子之间相结合的能力。当结合能＜0 kJ/mol 时，表示化合物与蛋白可以自发结合；结合能＜-5 kJ/mol 时，表明化合物与蛋白之间有较好的结合活性[7]，以此类推，结合能越小，两者间发生结合作用的可能性越大，并且结合得越稳定。所得对接结果如表3 所示，结果表明，除了TLR9、LCK 两个靶点不能与AcOBOA 自发结合外，其余靶点均能与AcO-BOA 自发结合，且有较好的结合活性，其中AcO-BOA 与AKT1 的结合能为-5.64 kJ/mol，说明AcO-BOA 与AKT1 能稳定的结合，验证了上述网络药理学所预测的结果，表明AcO-BOA 可能通过调控PI3K-Akt信号通路产生抗肝损伤的药理作用。利用Pymol软件对结果进行可视化，见图5。

图5 AcO-BOA与核心靶点的分子对接结果图

表3 分子对接结果

2.7 5 组血清ALP 含量及AKT/p-AKT 蛋白表达量比较 与正常组相比，模型组血清中ALP含量及p-AKT蛋白表达量显著升高，AKT蛋白表达量显著降低（均P＜0.01）；与模型组相比，AcO-BOA低、中、高剂量组中ALP含量均显著降低，AcO-BOA中、高剂量组p-AKT 蛋白表达量显著降低，AcO-BOA 高剂量组AKT蛋白表达量显著升高（均P＜0.01），见图6。

图6 5组小鼠血清ALP含量及肝组织AKT、p-AKT蛋白表达比较

3 讨论

ALI 的病因主要有药物毒物反应、肝脏脂肪病变、自身免疫性疾病等[8]。肝损伤是急性肝衰竭的基础，严重或持续性肝损伤会导致肝衰竭[9]。对于急性肝衰竭，目前除了肝移植外，临床上缺乏有效的治疗药物和方法[10]。前期研究结果表明，AcOBOA可以改善四氯化碳所导致的肝纤维化，但其对ALI的具体机制尚不明确，需要进一步探讨。

本研究运用网络药理学获取AcO-BOA发挥防治ALI的潜在靶点及信号通路，共得到10个核心靶点，依次是AKT1、EGFR、TLR4、SRC、TLR9、JAK1、LCK、APP、CHEK1 和EP300。蛋白互作关系表明AKT1在Top 10靶点中的作用尤为重要，提示AKT1可能是AcO-BOA 防治ALI 过程中的重要靶点。GO 和KEGG 通路富集结果表明AcO-BOA 防治ALI 过程中主要参与的生物学过程有先天免疫反应、炎症反应的正调控、调节细胞增殖、蛋白质磷酸化等；主要的信号通路有PI3K-AKT信号传导途径、癌症途径、Toll 样受体信号通路、弓形虫病、甲状腺激素信号通路、破骨细胞分化等。上述结果表明AcO-BOA 可以通过多靶点，多通路发挥抗肝损伤作用，且AKT1 及PI3K-AKT 信号通路在AcO-BOA防治ALI 中具有重要意义。许多研究表明，PI3KAKT信号通路在防治ALI过程中具有重要地位，如Zhong等[11]研究表明，姜黄素抑制PI3K/AKT通路的激活，促进脂多糖诱导的肝损伤细胞凋亡。

动物实验结果表明，AcO-BOA 能显著降低血清中ALP含量，血清中ALP的水平常用于肝脏疾病的诊断与治疗，表示AcO-BOA 对小鼠ALI 有一定的保护作用。PI3K-AKT 途径在细胞中普遍存在，并且在许多疾病发生发展中起着重要作用。牛艳邦[12]研究发现，在Toll 样受体介导的炎症发生时抑制PI3K 信号，可以抑制促炎因子的分泌以及增加抗炎因子IL-10的分泌。PI3K/Akt途径在调节细胞生长、增殖、分化、运动、存活和细胞内运输中起着关键作用[13]。PI3K是该信号通路的关键因子，AKT也称蛋白激酶B，是PI3K下游重要的效应物。PI3K被激活后，生成3位磷酸化的磷脂产物，该产物使得AKT在磷酸肌醇依赖性酶(PDK)的作用下发生磷酸化后进而正性调控细胞周期，促进细胞周期的转换[14]。动物实验结果显示，经LPS/D-GalN 造模后，AcO-BOA 的预处理能下降p-AKT 蛋白的表达，表明AcO-BOA 可以抑制AKT 的磷酸化，抑制PI3K/AKT信号通路，降低LPS所引起的炎症反应。

综上所述，本文以ACO-BOA为研究对象，结合网络药理学方法，对其发挥ALI 的保护作用机制进行探讨。研究结果初步表明，ACO-BOA 能够有效预防小鼠ALI的发生，其作用机制可能与调控PI3K/AKT信号通路有关，为进一步研究提供了新的思路和理论依据，但仍需深入地对相关靶点和通路进行实验验证。