LncRNA SNHG7靶向调节miR-146a-5p对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和细胞凋亡的影响*

赵 梦，汪玉宝△，邵 婧，杨 梅

（湖北省鄂州市中心医院 1.全科医学科；2.消化内科，鄂州 436000）

胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，早期胃癌主要通过手术治疗，但多数患者确诊时已属中、晚期，其恶性程度高，预后差[1]。靶向治疗给晚期胃癌患者带来了希望，已有部分靶向药物用于胃癌的治疗，但仍需研发更多新的靶向药物[2]。研究表明，非编码RNA 微小RNA（miRNA）及长链非编码RNA（lncRNA）均参与了胃癌的发生发展过程，且lncRNA还可作为竞争性内源RNA（ceRNA）与靶基因竞争结合miRNA，进而参与调控胃癌进程[3]。研究发现，长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因7（lncRNA SNHG7）在胃癌组织中高表达[4]。干扰SNHG7 表达通过调节P15 和P16 抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡且可抑制体内肿瘤的生长[5]。抑制SNHG7 表达可抑制宫颈细胞的增殖和侵袭，且与患者预后相关[6]。研究报道miR-146a-5p 通过靶向Rho 相关的含卷曲螺旋蛋白激酶1（Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1，ROCK1）诱导非雄激素依赖性前列腺癌细胞凋亡[7]。miR-146a-5p过表达显著抑制了乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移[8]。miR-146a-5p在胃癌中低表达，与肿瘤发生密切相关，可用于胃癌的诊断和预后[9]。且研究发现miR-146a-5p 在具有高腹膜转移潜能的胃癌细胞中表达下调[10]。然而，miR-146a-5p对胃癌细胞恶性生物学行为的应激尚未可知，SNHG7 对胃癌细胞迁移、侵袭的影响及其机制是否与miR-146a-5p 有关尚不清楚。本实验旨在研究SNHG7 是否通过调控miR-146a-5p 影响胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡，以期为胃癌的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般资料 选取湖北省鄂州市中心医院2015年1月至2018年1月接收的患者23例，其中男13例，女10例，所有患者经病理诊断确为胃癌，术前均未接受过放、化疗治疗，临床病例资料完整，手术切除癌组织，样本收集经患者同意且签署知情同意书。

1.1.2 细胞与试剂 正常胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞NCI-N87、Hs-746T、NCI-SNU-16 购自ATCC；RPMI-1640 培养基购自北京泽平科技有限责任公司；SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；MTT 试剂盒、Annexin VFITC/PI试剂盒购自美国Sigma公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 人正常胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞NCI-N87、Hs-746T、NCI-SNU-16用RPMI-1640 培养液（含10%胎牛血清）培养；取对数生长期细胞NCI-N87，将SNHG7 干扰质粒（si-SNHG7）及其阴性对照（si-NC）分别转染至NCIN87中，记为si-SNHG7组、si-NC组；将si-SNHG7分别与anti-miR-NC、anti-miR-146a-5p 共转染至NCIN87 中，记 为si-SNHG7+anti-miR-NC 组、si-SNHG7+anti-miR-146a-5p组。

1.2.2 随访 以患者术后出院为观察起始，定期对患者进行电话随访同时结合患者复诊病历，随访内容包括有无复发、生存结局、生存时间，随访时间截止于2019 年5 月，纪录患者生存时间并计算生存率。

1.2.3 实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）检测SNHG7 和miR-146a-5p 的表达水平 提取组织及细胞总RNA，合成cDNA，按照说明书操作进行PCR，循环条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；相对表达量用2-△△Ct法计算。SNHG7 上游引物序列：5’-CTAGGGGACTGGGCTGCT-3’，下游：5’-AGGGTCTTAGGTTCCAGGCA-3’；β-actin上游引物序列：5’-CTCCATCCTGGCTCGCTGT-3’，下游：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’；miR-146a-5p 上游引物序列：5’-CGGATCCTTGGTCTCCTCCAGATGTTTAT-3’，下游：5’-CCTCGAGTCATTAAAGTGATTTCTCCCAAG-3’；U6 上游引物序列：5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，下游：5’-CG-CTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.4 MTT 检测细胞活力 收集细胞，按MMT 试剂盒说明书操作，每孔分别加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于培养箱中继续孵育4 h 后弃去上清液，每孔加入DMSO150 μL，振荡反应10 min 使沉淀溶解，最后用酶标仪检测490 nm处吸光度（A）值。以A值表示细胞活力。

1.2.5 Transwell 检测细胞迁移和侵袭 将细胞在无血清的培养液中饥饿12～24 h，终止消化后离心去除培养液，调整细胞浓度为5×105/mL；细胞迁移实验：将200 μL细胞悬液和600 μL RPMI-1640培养液分别添加到Transwell 的上室和下室，培养24 h，取出小室并吸除培养液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS溶液冲洗2次，室温下加入0.1%结晶紫染色30 min，冲洗2次，用无菌棉球轻轻擦去上室表面细胞，微镜下观察并拍照。细胞侵袭实验：用Matrigel 包被Transwell上室，其余与细胞迁移实验步骤相同。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 收集细胞，用预冷的PBS 漂洗2 次，然后加入10 μL 的Annexin VFITC，再加入5 μL的PI，混匀后避光孵育10 min；上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.7 蛋白质印迹（Western blotting）法检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表达 提取细胞总蛋白，用BCA 定量。取40 μg 蛋白样品进行SDSPAGE，先用90 V 电压跑30 min，再用120 V 电压跑2 h，然后经电转将蛋白转移至PVDF上；用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 多克隆抗体（1∶800），4 ℃冰箱孵育过夜，PBS 洗涤3 次，5 min/次；再加入山羊抗兔IgG-HRP（1∶1 200）室温孵育2 h，PBS 洗涤3 次，10 min/次，加入化学发光液显影，定影，成像后用Quantity One检测蛋白条带灰度值，以目的条带和β-actin条带的比值作为蛋白表达水平。

1.2.8 荧光素酶报告实验检测SNHG7对miR-146a-5p 的靶向调控 starBase 数据库显示SNHG7 与miR-146a-5p存在结合位点。构建SNHG7的野生型和突变型荧光素酶表达载体，将其分别与miR-NC和miR-146a-5p 共转染至细胞NCI-N87 中，按照说明书检测荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSDt检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA SNHG7在胃癌细胞株中的表达情况

与人正常胃黏膜上皮细胞GES-1 相比，胃癌细胞NCI-N87、Hs-746T、NCI-SNU-16 中LncRNA SNHG7表达水平显著升高（P＜0.05），见表1。根据所有患者组织标本中检测的SNHG7 的平均表达量，将其分为高表达和低表达组，LncRNA SNHG7高表达的患者生存率低于低表达的患者生存率，见图1。

表1 胃癌细胞株中LncRNA SNHG7的表达 ，n=9

表1 胃癌细胞株中LncRNA SNHG7的表达 ，n=9

与人正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比，*P＜0.05。

图1 LncRNA SHNG7高表达和低表达患者的生存率（n=23）

2.2 LncRNA SNHG7 的敲减对胃癌细胞NCI-N87的增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

与si-NC 组相比，si-SNHG7 组胃癌细胞NCIN87 中SNHG7 表达水平降低，细胞活力降低，细胞迁移、侵袭数降低，细胞凋亡率升高，E-cadherin 蛋白表达水平升高，N-cadherin 蛋白、Vimentin 蛋白表达水平降低（P＜0.05），见图2、图3和表2、表3。

表2 lncRNA SNHG7的敲减对NCI-N87细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响 ，n=9

表2 lncRNA SNHG7的敲减对NCI-N87细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响 ，n=9

表3 LncRNA SNHG7的敲减对NCI-N87的迁移、侵袭相关蛋白表达的影响

表3 LncRNA SNHG7的敲减对NCI-N87的迁移、侵袭相关蛋白表达的影响

图2 LncRNA SNHG7敲减对NCI-N87细胞凋亡的影响

图3 LncRNA SNHG7的敲减对NCI-N87的迁移、侵袭相关蛋白表达的影响

2.3 LncRNA SNHG7 靶向miR-146a-5p，抑制miR-146a-5p的表达

starBase3.0 网站预测显示，LncRNA SNHG7 与miR-146a-5p 有结合位点，见图4。与miR-NC 组相比，miR-146a-5p组转染野生型表达载体的NCI-N87细胞荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），见表4。抑制SNHG7 表达后miR-146a-5p 表达水平升高（P＜0.05），见表5。

图4 LncRNA SNHG7与miR-146a-5p的结合位点

表4 NCI-N87 细胞中lncRNA SNHG7 与miR-146a-5p 的靶向关系 ，n=9

表4 NCI-N87 细胞中lncRNA SNHG7 与miR-146a-5p 的靶向关系 ，n=9

表5 NCI-N87 细胞中lncRNA SNHG7 的敲减对miR-146a-5p的表达的影响 ，n=9

表5 NCI-N87 细胞中lncRNA SNHG7 的敲减对miR-146a-5p的表达的影响 ，n=9

2.4 miR-146a-5p在胃癌细胞株中的表达

与人正常胃粘膜上皮细胞GES-1 相比，胃癌细胞NCI-N87、Hs-746T、NCI-SNU-16 中miR-146a-5p表达水平显著降低（P＜0.05），见表6。

表6 胃癌细胞株中miR-146a-5p的表达 ，n=9

表6 胃癌细胞株中miR-146a-5p的表达 ，n=9

与人正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比，*P＜0.05。

2.5 抑制miR-146a-5p 的表达逆转了敲减SNHG7对NCI-N87细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

与si-SNHG7+anti-miR-NC 组相比，si-SNHG7+anti-miR-146a-5p 组miR-146a-5p 表达水平降低，细胞活力升高，细胞迁移、侵袭数升高，细胞凋亡率降低，E-cadherin 表达水平降低，N-cadherin 蛋白、Vimentin蛋白表达水平升高（P＜0.05），见图5、图6和表7。

图5 抑制miR-146a-5p表达逆转敲减lncRNA SNHG7对NCI-N87细胞凋亡影响

图6 抑制miR-146a-5p 表达逆转敲减lncRNA SNHG7 对NCI-N87细胞迁移、侵袭相关蛋白表达的影响

表7 抑制miR-146a-5p表达逆转敲减lncRNA SNHG7对NCI-N87细胞和迁移和侵袭的影响 ，n=9

表7 抑制miR-146a-5p表达逆转敲减lncRNA SNHG7对NCI-N87细胞和迁移和侵袭的影响 ，n=9

与si-NC组相比，*P＜0.05;与si-SNHG7+anti-miR-NC组相比，#P＜0.05。

3 讨论

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，发病率较高，现有的胃癌治疗手段有限，手术和放疗、化疗方法还未能达到理想效果，亟需新的治疗方法[11]。研究表明，lncRNA 参与胃癌的发生发展过程，在胃癌诊断、靶向治疗和预后等方面具有广阔前景[12]。研究报道，SNHG7 在乳腺癌组织中显著上调，抑制SNHG7 可以抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭[13]。敲低SNHG7 抑制了肝癌细胞在体外的增殖，迁移和侵袭[14]。SNHG7通过调节miR-34a抑制骨肉瘤中细胞活力，迁移和侵袭以及EMT，诱导细胞凋亡[15]。lncRNA SNHG7 通过增强Fas 凋亡抑制分子2（Fasapoptotic inhibitory molecule 2，FAIM2）表达来促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制其凋亡[16]。以上研究表明，lncRNA SNHG7 参与调控多种肿瘤的发生发展进程，其多作为促癌基因起作用；但其对胃癌细胞的影响尚不其清楚。本实验首先用qPCR检测胃癌细胞中SNHG7的表达水平，结果发现SNHG7 高表达，且生存曲线结果显示，SNHG7 高表达的患者生存率低（P＜0.05），说明SNHG7 在胃癌中也起促癌基因作用，其可能影响患者预后。将抑制SNHG7表达载体转染至胃癌细胞中，检测细胞恶性生物学行为，结果显示，细胞活力以及细胞迁移、侵袭数降低，细胞凋亡率升高，E-cadherin表达水平升高，N-cadherin、Vimentin 表达水平降低（P＜0.05）。E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 是EMT 过程中的标记物，EMT 与胃癌细胞体内转移有关，细胞迁移侵袭能力增强时N-cadherin、Vimentin 表达水平升高[17]。说明抑制SNHG7表达可抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT，并促进细胞凋亡；其在胃癌中的作用与在其他癌症中作用相似。

研究报道，miR-146a-5p 在颅内动脉瘤患者的血浆样本中高表达，与患者预后相关[18]。miR-146a-5p 可以抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制间充质标记N-cadherin、Vimentin 的表达并增加上皮标记E-cadherin的表达[19]。miR-146a-5p过表达还增强了人参皂苷Rh2诱导的肝癌细胞凋亡和抗增殖作用[20]。以上研究表明，miR-146a-5p在多种癌症中起抑癌基因作用，且影响患者预后。qPCR结果显示，胃癌细胞中miR-146a-5p 低表达（P＜0.05），表明miR-146a-5p 在胃癌中可能也起抑癌作用。本实验的双荧光素酶结果表明，SNHG7靶向调控miR-146a-5p。此外，抑制miR-146a-5p 表达逆转了抑制SNHG7表达对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响（P＜0.05），提示SNHG7 可能通过调控miR-146a-5p 影响胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡。

综上所述，抑制SNHG7 表达可能通过上调miR-146a-5p 表达抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡。