左侧星状神经节切除对慢性心力衰竭心功能的影响

颜 辉 吴 钢 王 乐 王 顺 毛 帅 江 洪 黄从新

慢性心力衰竭是多种原因导致心肌射血能力和(或)心室充盈功能下降的临床综合征，也是大多数心脏疾病发生、发展的终末阶段[1]。慢性心力衰竭的主要病理特征之一是自主神经失平衡，包括交感神经系统功能亢进和迷走神经功能减弱。交感神经的过度激活会促使心肌细胞凋亡增加和炎性反应持续产生[2]。抑制交感神经的活性是治疗慢性心力衰竭的重要手段。星状神经节是心脏交感神经支配的重要成分。2012年Conceião-Souza等[3]进行的一项前瞻性随机试验，初步证明左侧星状神经节切除治疗收缩性心力衰竭是安全的和有效的。本研究旨在探索左侧星状神经节切除对慢性心力衰竭心功能的影响及其机制，为临床治疗慢性心力衰竭提供依据。

材料与方法

1.实验动物：本研究中的所有动物程序均经武汉大学人民医院实验动物福利伦理审查委员会批准，由武汉大学人民医院动物中心提供实验动物(动物合格证编号：00270753)。动物使用过程严格按照北京大学制定的《动物保护与使用指南》执行。由武汉大学人民医院动物中心提供SPF级雄性大鼠24只，8周龄，平均体质量为200～250g。采用数字表法随机分为3组，即对照组(腹主动脉缩窄术，n=8)、LSG组(左侧星状神经节切除+腹主动脉缩窄术,n=8)和假手术组(左侧星状神经节切除假手术+腹主动脉缩窄术，n=8)。

2.试剂与仪器：无水乙醇、二甲苯购自国药集团化学试剂有限公司；苏木精染液、伊红染液购自美国Aspen公司；大鼠TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒购自英国Abcam公司；caspase-3、caspase-9抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；脱水机、包埋机、冻台、组织摊片机购自武汉俊杰电子有限公司；病理切片机购自上海徕卡仪器有限公司；小动物手术器械购自新华手术器械有限公司。

3.构建压力超负荷心力衰竭模型：大鼠在动物中心适应环境1周后，3组大鼠均行腹主动脉缩窄术心力衰竭模型造模。取仰卧位固定，腹腔内注射50mg/kg戊巴比妥钠麻醉成功后，在腹中段沿腹正中线做约2cm切口，钝性分离暴露腹主动脉，以22G号针头结扎，取出针头，制造约0.7mm直径的残腔，逐层缝合关闭切口，术后2天大鼠逐渐出现呼吸和心跳加速、畏寒倦怠和食欲减退等症状，提示手术造模成功。

4.左侧星状神经节切除：LSG组大鼠在完成腹主动脉缩窄术后进行左侧星状神经节切除手术。大鼠取仰卧位固定，沿颈部正中做1cm长切口，钝性分离后，显微镜下找到颈上神经节，距其下端3mm处离断星状神经节，断端结扎，缝合切口。术后5min内出现左侧眼球内陷、瞳孔缩小及上睑下垂等表现提示手术成功。假手术组仅进行左侧星状神经节分离，不予切除，逐层缝合，关闭切口。腹主动脉缩窄术后继续喂养10周。

5.超声心动图检测：腹主动脉缩窄术后10周行超声心电图检测，在二维超声引导下，探头在胸骨旁左心室长轴切面扫描，采集M型超声心动图，测量室间隔厚度(intra-ventricular septum diastole, IVSD)、左心室后壁舒张末期厚度(left ventricular posterior wall diameter, IVPWD)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDd)、左心室舒张末期容积 (left ventricular end diastolic volume, LVEDV)，取测量的3个心动周期的平均值，并按照Teichholt 公式计算出左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室缩短分数(left ventricular fraction shortening, LVFS)，评估大鼠心腔大小和射血功能。

6.心脏组织HE染色：大鼠处死后，立刻用眼科小剪刀剪取大鼠心尖部约5mm×5mm×5mm心肌组织，制备石蜡切片，各组随机选取3张切片，然后进行HE染色，在光学显微镜(×400)下观察心肌组织的形态结构和病理改变(心肌细胞形态、结构，心肌纤维排列，炎性细胞浸润)。

7.酶联免疫吸附测定检测心肌炎性细胞因子TNF-α和IL-6水平：获取心肌组织，组织匀浆，稀释待测样品和标准品至合适浓度，按100微升/孔加入到酶标板中，4℃过夜。TNF-α和IL-6抗体用稀释液，加入100微升/孔，在37℃环境下放置到湿盒45min。然后洗板3次。加入亲和素过氧化物酶复合物工作液100μl，在37℃环境下反应30min，依次加入TMB显色液，37℃避光反应30min，最后加入50μl终止液，用ELISA检测仪于450nm波长处测定吸光度值。

8.蛋白印迹检测心肌组织凋亡蛋白caspase-3和caspase-9蛋白的表达：获取心肌组织，蛋白提取试剂盒收集细胞蛋白，测定蛋白浓度。制备SDS-PAGE凝胶，上样、电泳、转膜。4℃环境下加入1∶100到1∶500稀释兔抗大鼠caspase-3、caspase-9多克隆抗体孵育过夜，加入1∶1000稀释HRP标记羊抗兔IgG抗体，室温孵育30min，显色系统中显色定影，分析杂交条带。

结 果

1.各组超声心动图心功能指标比较：各组超声心动图心功能指标IVSD、LVPWD、LVEDd、LVEDV、LVEF、LVFS比较，经方差分析，差异有统计学意义(P<0.05)。LSG组IVSD、IVPWD较对照组和假手术组低(P均<0.05),LVEDd、LVEDV较对照组和假手术组低(P均<0.05)，LVEF、LVFS较对照组和假手术组高(P均<0.05)。对照组和假手术组比较，心功能指标差异无统计学意义(P>0.05，图1，表1)。

表1 术后10周各组大鼠心功能的比较

图1 术后10周各组大鼠超声心动图结果A.对照组;B.LSG组;C.假手术组

2.各组心肌肥厚程度比较:各组HE染色结果显示，LSG组心肌细胞排列较规则整齐，而对照组和假手术组的心肌细胞空泡化，细胞间隙明显，部分细胞溶解(图2)。

图2 术后10周各组大鼠心肌HE染色结果(×400)A.对照组;B.LSG组;C.假手术组

3.各组心肌组织炎性细胞因子TNF-α和IL-6水平比较：LSG组炎性细胞因子明显低于对照组和假手术组，这说明LSG可以显著改善慢性心力衰竭的心脏炎性水平(表2)。

表2 术后10周各组大鼠心肌炎性细胞因子TNF-α、IL-6比较

4.各组心肌组织凋亡蛋白caspase-3和caspase-9表达量比较：LSG组细胞凋亡蛋白表达低于对照组和假手术组，这说明在心力衰竭第10周时，LSG可以明显减少慢性心力衰竭心肌细胞凋亡(图3)。

图3 术后10周各组大鼠心肌组织caspase-3和caspase-9表达

讨 论

本研究建立腹主动脉缩窄术后慢性心力衰竭大鼠模型，行左侧星状神经节切除手术，观察其对慢性心力衰竭大鼠心功能的影响。本研究的实验结果是腹主动脉缩窄术后10周，LSG组炎性细胞因子TNF-α、IL-6水平明显下降,凋亡蛋白caspase-3、caspase-9表达水平显著降低，心功能明显好转。

慢性心力衰竭是一种进展性病程，从代偿性心肌肥厚逐渐发展到心室重构及心肌纤维化，最终走入失代偿性终末期阶段[4,5]。众所周知，抑制交感神经的活性是治疗慢性心力衰竭的重要手段，比如药物治疗β受体阻滞剂。长期服用β受体阻滞剂可以明显改善慢性心力衰竭严重程度和提高慢性心力衰竭患者的生活质量。交感神经节切除是抑制交感神经活性的重要方法，主要用于遗传性室性心律失常如长QT综合征和环肺静脉消融的治疗。既往研究证实，左侧心脏交感神经去神经可减轻长QT综合征和儿茶酚胺能多形性室性心动过速患者的室性心律失常发作，也可能对治疗其他通道病和心肌病患者有利[6,7]。双侧心脏交感神经去神经支配可以降低室性心动过速或心室颤动的诱发性，并减轻交感神经激活对梗死心脏复极的影响[8]。

心脏交感神经节切除用于慢性心力衰竭治疗尚在探索之中。星状神经节由第1胸神经节与颈下神经节融合而成，是心脏交感神经支配的重要通路。多项研究表明，星状神经节干预治疗心力衰竭是可行的及有效的。即使全部切除左侧星状神经节后，右侧交感神经输出仍然存在[9]。郑建滨等[10]研究显示，腹主动脉缩窄法建立大鼠心力衰竭模型后，以0.1%利多卡因阻滞右侧星状神经节持续2周，与对照组和假手术组比较，星状神经节阻滞组大鼠的TNF-α、IL-1β水平较低，PI3K、Akt蛋白相对表达量较高,caspase-3蛋白相对表达量较低，高倍镜视野下TUNEL染色平均阳性数较少。Zhang等[11,12]研究慢性心力衰竭大鼠时发现，双侧星状神经节切除可以通过下调交感神经激素的表达，使得纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原纤维和Ⅲ型胶原纤维等心肌纤维化标志物明显减少，进而减轻心肌肥厚，改善心功能。这说明双侧星状神经节切除可以减轻慢性心力衰竭的心室重构和心肌纤维化水平。最近的另外一项研究显示，在星状神经节切除后10周，左侧、右侧星状神经节切除组较对照组Ⅰ型胶原纤维，以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的比值低(P=0.000)，慢性心力衰竭大鼠心功能明显好转[13]。

既往研究发现，心力衰竭和炎症密切相关。炎性反应已被证实参与慢性心力衰竭整个演变过程[14]。炎性细胞因子可以诱发心肌肥厚、心肌纤维化、左心室功能障碍和细胞凋亡[15]。炎性细胞因子如TNF-α、IL-6和慢性心力衰竭严重程度呈正相关[16]。通过抑制炎性反应来改善心脏功能已被广泛讨论并研究。最新有研究报道称交感神经系统可以调控心脏局部炎症。在心力衰竭中晚期阶段，随着交感神经系统兴奋性持续增高，交感神经和肾素-血管紧张素-醛固酮系统过度激活可能促使心力衰竭产生持续性的炎性反应[2]。在压力超负荷时，交感神经系统的激活会通过p53信号通路上调细胞间黏附分子-1和整合素表达，加重心功能障碍，从而促进心脏炎性反应[17]。有研究者提出，通过抑制过度兴奋的交感神经功能抑制炎性细胞因子的表达和细胞凋亡是可行的。本研究的实验结果与既往研究结果一致，LSG组TNF-α、IL-6水平明显下降，这说明左侧星状神经节切除可以抑制慢性心力衰竭大鼠的心脏炎症。

随着心力衰竭机制研究的不断深入，人们发现细胞凋亡与心力衰竭关系密切。近年来国内研究表明，星状神经节阻滞能够通过增强 PI3K/Akt 信号通路，降低凋亡相关基因蛋白的表达和心肌细胞凋亡指数，从而减轻左心室肥厚并改善心功能[18]。星状神经节切除是否同样具有抑制心肌细胞凋亡来改善心力衰竭心功能的作用，目前暂没有相关研究报道。本研究发现，腹主动脉缩窄术后10周，LSG组凋亡蛋白caspase-3、caspase-9表达水平显著降低。本研究证实了左侧星状神经节切除可以抑制慢性心力衰竭大鼠的心肌细胞凋亡。

本研究存在的不足：①未进行细胞层面及相关的信号通路研究；②未进行临床实验来验证左侧星状神经节切除对慢性心力衰竭治疗效果；③本研究缺乏左侧星状神经节切除与临床一线药物如β受体阻滞剂的对比研究。

综上所述，本研究表明，左侧星状神经节切除通过抑制心脏炎症和心肌细胞凋亡明显改善慢性心力衰竭大鼠心功能。