明胶基生物墨水在药学研究中的应用

陈俊根，张雷，何原子，张峻颖，吴春勇

(1.中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室，江苏 南京 210009;2.中国药科大学药物分析教研室，江苏 南京 211198;3.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101；4.中国药科大学中药制剂教研室，江苏 南京 211198)

新药研究领域一般通过临床前动物试验评价其成药性，但由于种属差异的存在，结果外推到人体存在很大的不确定性[1]。因此，基于人源细胞开发人体体外模型具有重要意义。目前药物筛选最常用的体外模型是二维(2D)细胞培养，具有易操作、生长环境可控、细胞生长可视化、重现性好、高通量等优点[2]，但由于缺乏细胞-细胞间、细胞-基质间相互作用，可能误导药物作用的预测[3-4]。研究发现，三维(3D)体外模型可以更好地模拟体内复杂的微环境，为新药筛选提供更可靠的开发策略与技术平台。但传统3D体外模型的构建方法，如刚性支架[7]、旋转瓶[8]、悬滴[9]、超低黏附培养[10]和微孔阵列[11]等忽略了细胞外基质的作用，不利于重现细胞在体内的微环境[12]，模型尺寸也受到很大限制[13]。更为重要的是，复杂的3D类器官需要更精确的多细胞结构以及血管网络的整合，而传统的组织工程技术无法满足这些要求[14-16]。

3D生物打印是一种新兴的、革命性的组织工程技术，将生物材料按照预先设计好的模型，以自动化方式层层打印，可以构建结构复杂、功能成熟的人体类器官，为新药评价提供与体内功能更相似的体外模型[17-18]。生物打印技术可分为4类：挤出型打印(extrusion-based bioprinting)、喷墨型打印(inkjet-based bioprinting)、立体光刻(projection stereolithography)以及激光诱导转移打印(laser induced forward transfer)[19](见图1)。其中，挤出型打印技术是性能最全面，也是应用最为广泛的生物打印技术[20]。打印时所用的充满细胞的水凝胶被称为生物墨水，也就是具有良好的打印活细胞能力的生物材料配方，是生物打印的核心[21]。

图1 4种常用的的生物打印技术(已获得引用许可)

目前常用的生物墨水主要分为天然多聚物及其取代物，以及合成的高聚物[22]。常用的天然多聚物包括明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、海藻酸钠等，合成的高聚物多来源于水凝胶材料，包括聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)等。明胶是生物打印领域常用的生物材料，与胶原蛋白、纤维蛋白等天然基质相比，明胶价格低廉、更容易获得；与合成聚合物相比，明胶能够提供细胞黏附生长的位置以及缓慢水解与酶解特性。近年来，随着脱细胞基质提取技术的成熟，与人体内生物基质环境更接近的脱细胞基质(dECM)有望在生物打印中成为主流材料[23]，但不稳定的材料来源限制了dECM的广泛应用[24]。因此，尽管性质优良的新型材料不断出现，但由于低廉的成本、优越的生物化学和生物力学性质，明胶基生物墨水仍然是生物打印领域最常用的墨水配方。此外，明胶修饰物甲基丙烯酰明胶(GelMA)的合成方法日趋成熟，可以在不同的材料来源、不同实验室实现稳定的产率。目前，基于明胶基或GelMA基生物墨水打印的3D体外模型在新药筛选和毒性评价领域日益受到关注。

1 基于明胶的生物墨水

1.1 组织工程中的明胶 根据制备工艺的不同，明胶可分为A、B两种类型，B型明胶较A型明胶黏度更高[25-27]。根据来源的不同，明胶可分为鱼皮来源和哺乳动物来源，由于鱼皮来源明胶的胶凝温度低，机械性能差[28]，组织工程中多使用哺乳动物来源。明胶具有多种优良的物理性质，包括：①生物相容性；②可温度编程特性；③高度分散性；④持水性；⑤可降解性，因此基于明胶的生物墨水在3D生物打印中得到了极为广泛的应用[29]。然而，生物打印很少单独使用明胶溶液作为生物墨水，这是由于其较差的机械支撑能力和缺乏温和有效的交联手段[30]。为了解决这些难题，人们加入交联条件温和的交联剂作为改性剂，同时改善明胶的机械特性以获得良好的可打印能力。

1.2 明胶与改性剂的结合 海藻酸钠是一种天然多糖，溶于水形成高黏度溶液，在钙离子的存在下通过离子交联作用形成稳定的水凝胶，强度随着钙离子浓度的增大以及交联时间的延长而增强[31]。形成的交联结构可被螯合剂EDTA解交联，极大方便了药物孵育后的细胞收集与分析[32]。但海藻酸钠不具备明胶的水解特性，其高亲水特性不利于细胞的黏附生长[33-34]。为此，人们在明胶中加入海藻酸钠，结合明胶的可温度编程特性与海藻酸钠的黏度及交联能力，形成具有优良打印特性的混合生物墨水[35]。Xie等[36]使用来源于不同肝癌患者个体的原代肝癌细胞，基于明胶-海藻酸钠墨水，打印的个性化肝癌模型对索拉菲尼等4种肝癌一线药物表现出不同的抗药性，在个性化药物筛选领域展现出良好的应用前景。

海藻酸钠的加入虽然改善了明胶墨水的可打印性，但是添加单改性剂的混合生物墨水与体内细胞生长的细胞外基质环境仍相差较远[37]。纤维蛋白原是一种常用的添加材料，可以起到补充ECM和增强交联稳定性的作用。Zhao等[38]在明胶-海藻酸钠的配方中加入了纤维蛋白原，打印的大鼠肝脏类器官能保持良好的肝细胞活力，与2D培养相比，此模型对抗癌药表现出更高的耐药性，能够更真实反映药物的体内药效。Zhao等[39]使用明胶-海藻酸钠-纤维蛋白原的混合生物墨水，装载HeLa细胞打印的3D模型相较于2D模型，对紫杉醇表现出更高的耐药性。Dai等[40]添加纤维蛋白原，以CaCl2和转谷氨酰胺酶(TG)作为交联剂，装载胶质瘤干细胞(SU-3)打印的3D模型对替莫唑胺具有更强的耐药性。MatrigelTM是一种商品化的与体内基质环境类似的凝胶材料。Mao等[41]在明胶-海藻酸钠基础上加入MatrigelTM以模拟细胞外基质(ECM)，装载人原代肝内胆管肿瘤细胞后，打印的肿瘤模型对顺铂、5-氟尿嘧啶、索拉菲尼可以表现明显的耐药性。

由于人体内ECM成分复杂，研究者还尝试加入人源的脱细胞基质(hECM)，以更好地模拟体内的细胞-基质相互作用[35，42-43]。Hiller等[35]采用明胶-海藻酸钠-hECM混合生物墨水，打印了人肝祖细胞(HepaRG)，由于提供了更多的细胞黏附生长位点，此人体肝脏类器官模型的代谢活性较2D单层培养明显增强，且支持体外的腺病毒转染，为抗病毒药物的筛选提供了技术手段。

除海藻酸钠外，明胶与其他材料的结合可以打印出复杂的管腔结构。Homan等[44]将纤维蛋白作为添加剂与明胶组成混合生物墨水，以泊洛沙姆(Pluronic)为牺牲材料，用于体外肾小管模型的构建，对肾毒性药物环孢菌素表现出剂量依赖性的屏障破坏，可用于体外肾毒性药物的筛选(见图2)。

图2 a.近曲小管示意图；b.生物打印近曲小管示意图

2 基于修饰化明胶的生物墨水

2.1 GelMA生物墨水 与添加交联剂进行物理交联相比，通过化学修饰获得光交联能力的GelMA能够实现更加快速、均匀的原位交联[45]。GelMA是一种明胶修饰产物，由明胶分子上的氨基与小分子的甲基丙烯酸酐在碱性条件下结合形成，此反应适用于A型和B型明胶[46-47](见图3)。在长波长紫外线(UV)照射下，GelMA能够与2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯乙酮(Irgacure 2959)和苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)等水溶性光引发剂形成稳定水凝胶。通过控制氨基被取代的程度，可以得到不同机械特性的水凝胶[48-50]。Xie等[51]使用纯GelMA生物墨水，结合喷墨打印技术构建了3D肿瘤阵列芯片，与2D培养相比，对阿霉素和紫杉醇表现出更高的耐药性。Bhise等[52]使用GelMA包裹HepG2，打印于微流控芯片上，紫外照射后组装芯片灌流培养，构建的3D肝脏模型可以在30 d内保持正常功能，采用高浓度对乙酰氨基酚孵育后，出现明显的毒性反应。

图3 GelMA的合成方法示意图(已获得引用许可)

2.2 GelMA墨水与改性剂的结合 在获得新的光交联能力的同时，GelMA仍保留了明胶的低黏度特性，因此必须对打印过程中的黏度进行控制。为此，海藻酸钠被用于增强GelMA溶液的黏度，从而优化其可打印性。通常与同轴双层或多层喷头联用，载细胞的GelMA-海藻酸钠墨水由中心挤出，CaCl2溶液同时由外层挤出，以原位交联提高打印的保真度[53]。此混合生物墨水装载HUVEC细胞打印后，进行心肌干细胞接种，得到的心脏类器官模型对阿霉素表现出明显的剂量依赖毒性，可用于心脏毒性药物的体外筛选。

2.3 GelMA墨水与牺牲材料的结合 近年来，越来越多的研究将GelMA与牺牲材料结合，从而优化打印策略，构建更加复杂的血管网络结构，以提供更加可靠的体外药物筛选或毒性评价模型。Ouyang等[54]将明胶作为牺牲材料与GelMA联用，进行无缝隙的生物材料沉积，灌流管路37 ℃加热去除明胶后，得到了具有管状几何形状的复杂3D网络结构。Kolesky等[55]使用可温度编程的生物材料泊洛沙姆(Pluronic-F127)作为牺牲材料，以GelMA为生物墨水，结合聚二甲基矽氧烷(PDMS)生物材料，采用多喷嘴打印出微通道。Massa等[56]使用GelMA墨水，以琼脂作为牺牲材料，装载人肝癌细胞(HepG2)和HUVEC细胞打印了具有血管网络结构的肝脏模型，并用于药物肝毒性的筛选(见图4)。

图4 a.血管化肝结构示意图；b.具有可灌注血管结构的3D肝组织结构的制造(已获得引用许可)

3 小结

基于明胶独特的理化性质、出色的生物学特性以及适用于多种打印技术的灵活性，人们结合海藻酸钠、纤维蛋白、MatrigelTM等改性剂，开发了多种基于明胶的生物墨水，生物打印了过去难以实现的复杂组织结构。与2D传统模型相比，打印的体外类器官模型在药物筛选和毒性评价等研究中表现出更高的预测性。随着生物材料研究的不断深入，有望开发出具有更佳打印特性的明胶基生物墨水，结合不断进步的生物打印策略，优化细胞来源，可以打印形状与功能上与人体组织器官更加接近的3D组织类器官，在新药筛选领域发挥更大的作用。