LAMP法和传统培养法检测下呼吸道感染常见病原体的比较研究

徐晓娜 孙 昕 王莉莉 董全江 李培杰

据世界卫生组织(world heath organization，WHO)2018年最新统计数据显示，世界十大死亡原因中，下呼吸道感染排第4位，低收入国家十大死因中，下呼吸道感染位居第一。引起呼吸道感染的病原体主要有细菌、病毒、支原体、衣原体等，下呼吸道感染病死率居高不下的主要原因是没有获得快速准确的诊断和治疗。传统的病原微生物检测主要靠细菌培养或免疫学方法，传统培养法虽然是诊断下呼吸道感染的金标准，但存在很多缺陷：细菌培养周期长，阳性率低，每次只能鉴定一种病原体，对特殊病原体如流感嗜血杆菌、肺炎支原体等的检测能力弱。环介导等温扩增(Loop—mediated isothermal amplification，LAMP)技术具有快速准确、敏感性高、特异性强、操作简单，并可同时检测13种常见下呼吸道感染病原体等优点，本研究利用LAMP芯片技术，分析青岛市市立医院住院的疑似下呼吸道感染患者病原菌分布情况，并与传统培养法比较，分析评价LAMP芯片法检测下呼吸道病原体的效果。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2019年7～12月在青岛市市立医院住院的疑似下呼吸道感染患者痰液标本2 430例，其中男性1 440例，女性990例，年龄1～99岁，平均(64.2±17.5)岁。采用自然咳痰或气管插管收集深部浓痰于无菌容器送检。合格的痰液要求：白细胞数>25个/低倍视野，且上皮细胞<10个/低倍视野。

1.2 方法

1.2.1 传统培养法细菌学检查 病原菌分离和培养按照《全国临床检验操作规程》第3版进行，羊血琼脂平板和麦康凯平板均为法国梅里埃公司产品。细菌鉴定采用BD公司Poenix-100全自动细菌鉴定系统。质量控制菌株铜绿假单胞菌ATCC27853，大肠埃希菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923，粪肠球菌ATCC29212均购自美国Micro Biologies公司。

1.2.2 LAMP芯片法核酸检测 参照晶芯©呼吸道病原菌核酸检测(LAMP芯片法)试剂盒说明书，向无菌容器内的痰标本中加入等体积的10% NaOH，充分振荡混匀，37℃液化30 min，取1 mL液化后液体离心弃上清，洗涤，加入核酸提取液提取DNA备用。取痰液DNA 34.5 μL与20 μL恒温扩增试剂混匀，取50 μL上述配好的核酸扩增反应体系加入芯片，离心，用RTisochip-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪(博奥生物集团有限公司)进行检测，扩增条件设为：37℃预热3 min，65℃ 47 min扩增，结果用相应软件进行分析。本试剂盒的每个芯片均设有24个反应池(结构见图1)，每个反应池包埋固定一套引物用于一种核酸靶序列的扩增与检测，其中包括1个阳性质控、9个阴性质控和13个病原菌反应池，可一步完成对13种常见下呼吸道病原菌的检测，包括肺炎衣原体、肺炎支原体、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、耐甲氧西林葡萄球菌、结核分枝杆菌复合群、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌。

图1 碟式芯片结构图

1.3 统计学方法 运用SPSS 20.0进行统计分析，计数资料用百分比表示，采用

χ

检验；痰培养与LAMP芯片法检验结果的一致性分析采用Kappa分析，0.0～0.20表示极低的一致性，0.21～0.40表示一致性一般，0.41～0.60表示一致性中等，0.61～0.80表示高度一致性，0.81～1表示几乎完全一致。以

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAMP法对下呼吸道感染常见病原体检出情况 2 430例下呼吸道感染痰液标本，LAMP法检出阳性标本1 132例，总阳性率为46.58%。单一病原体感染653例(26.87%)，混合感染479例(19.71%)，其中两种病原体混合感染317例(13.05%)，三种病原体混合感染112例(4.61%)；共检出呼吸道病原体12种，其中流感嗜血杆菌阳性率最高，嗜肺军团菌未检出。见表1。

表1 2 430例呼吸道标本病原体检出情况

2.2 传统培养法对下呼吸道感染常见病原体检出情况 1 905例下呼吸道感染痰液标本经传统培养法检测病原体均为优势菌株，排除了混合菌株感染，共检出阳性440例，阳性率23.10%，单一病原体感染338例(17.74%)，混合感染102例(5.35%)，其中两种病原体混合感染84例(4.41%)，三种病原混合感染14例(0.73%)。见表2。

表2 1 905例呼吸道标本病原体检出情况

2.3 LAMP法与传统培养法阳性率及阳性符合率一致性比较 1 905例下呼吸道感染痰液标本同时行LAMP法和传统培养法检测病原体，LAMP法阳性率为48.38%，显著高于传统培养法(23.10%)(

χ

=341.815，

P

<0.05)。两种方法总体阳性符合率的Kappa>0.4。见表3。LAMP芯片法检测的每种病原体阳性率均高于传统培养法(

P

<0.05)。两种方法检出铜绿假单胞菌的阳性率有高度一致性(Kappa=0.658)，鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌阳性率有中等一致性(0.4

表3 LAMP法与传统培养法阳性率及阳性符合率一致性比较(例)

表4 LAMP法和传统培养法检测到8种致病菌的阳性率

3 讨论

下呼吸道感染是一个全球范围的严重公共卫生问题，它常为多种呼吸系统疾病的诱因，并涉及种类繁多的病原体，下呼吸道感染的持续进展，能够导致患者重症肺炎或者脓毒血症的发生，增加了患者不良心肺结局的发生风险。目前，在短时间内做出明确的病原学诊断并进行有针对性的治疗依然很困难，这也是该病死亡率高的主要原因。LAMP芯片技术是Notomi等在2000年开发的一种新型恒温核酸扩增方法，通过链置换DNA 聚合酶，在约65℃恒温条件下可完成核酸扩增反应。LAMP芯片技术具有快速准确、敏感性高、特异性强、操作简单，并可同时检测13种常见下呼吸道感染病原体，最快2 h即可检出病原菌等优点。本研究LAMP芯片法共检测2 430例下呼吸道感染痰液标本，阳性率46.58%，流感嗜血杆菌(16.30%)是主要下呼吸道致病菌，与刘志远等、李素娟等、蒋丽莉等研究结果一致。而王胜等、陈艳玲的研究发现铜绿假单胞菌是下呼吸道感染的主要病原菌，王帆等、王淑玲等研究发现肺炎链球菌是下呼吸道感染的主要病原菌，与本研究结果不同。分析原因可能和纳入的人群年龄结构和来源有很大关系，中国各地区气候及空气污染程度不同也是造成病原体感染率存在差异的重要因素，另外这种差异还可能受经济差异以及临床医师用药习惯的影响，标本的采集方法、医院的诊疗水平和所用的检测方法也可对结果产生影响，具体原因有待进一步研究探讨。

本研究结果显示，LAMP法总阳性率(48.38%)远高于传统培养法总阳性率(23.10%)，且LAMP法检出的8种病原菌阳性率均高于传统培养法，与之前的研究报道类似，分析原因：①传统病原体培养对于样本来源、样本条件、操作要求等多方面要求较高，导致阳性率不高；②LAMP芯片法能够从极微量的病原体遗传物质中进行拷贝和扩增，检测灵敏度较高；③有些病原体如流感嗜血杆菌，服药后培养阳性率会降低。LAMP芯片法检出的主要病原菌前3位分别为流感嗜血杆菌(16.30%)、肺炎克雷伯菌(9.75%)和耐甲氧西林葡萄球菌(9.05%)，与赵溜的研究结果一致。传统培养法检出的主要病原菌为铜绿假单胞菌124例(6.51%)、鲍曼不动杆菌117例(6.14%)、肺炎克雷伯菌105例(5.51%)，而黄红春等研究发现，检出率居前3位的致病细菌依次为肺炎克雷伯菌126株(33.07%)、鲍曼不动杆菌83株 (21.78%)、铜绿假单胞菌49株(12.86%)。本研究LAMP芯片法和传统培养法检测结果具有中等一致性，其中铜绿假单胞菌的阳性检出率具有高度的一致性，其次是鲍曼不动杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌阳性率有中等一致性，而苛养菌(肺炎链球菌和流感嗜血杆菌)阳性率一致性较低，与魏晓楠等研究结果一致。由于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌对培养条件要求较苛刻，在普通培养基中难以生存，故痰培养阳性率低，LAMP法检测阳性率明显升高，2者阳性率无一致性，与Sekim 等研究吻合。同样，王咏红等研究发现LAMP法对病原体的检出率明显高于传统培养法，特别是对于流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。郑东宇等测序结果分析显示，LAMP扩增区不同菌株序列一致性约为95%，具有很好的保守性，核酸检测技术的敏感度高于传统培养法。

综上所述，LAMP芯片法与传统培养法相比，能够快速诊断下呼吸道感染病原菌，提高阳性率并同时检测支原体、衣原体和军团菌等非典型病原体，达到快速诊断的目的，做到早发现、早治疗，避免延误最佳治疗时机。但本研究也存在一定局限性，如检测病例数较少，对象主要来源于同一医院的住院患者，后期还需要增加样本量，扩大研究规模，争取为本地区乃至全国提供可靠的呼吸道感染病原体流行趋势。