铁皮石斛无菌悬浮培养育苗工艺开发

琚可可， 王如月， 朱奇彪

(1.杭州笑哈哈生态农业有限公司，浙江 杭州 311107； 2.浙江农艺师学院，浙江 杭州 310021；3.浙江省农业科学院 农村发展研究所，浙江 杭州 310021)

铁皮石斛是传统名贵中药材，其清补滋养的功效得到历代名家的肯定。近30 a的产业化开发，在全国范围内形成以浙江省为中心的铁皮石斛培育加工产业链，年产值超百亿的庞大产业规模。铁皮石斛滋阴清润强免疫力的确切功效得到消费市场的广泛认可，巨量的消费需求，拉动了产业链各环节的蓬勃发展，铁皮石斛下游企业加工量的急剧增加带动上游药材原料种植规模快速扩张。浙江的铁皮石斛产业化起步早，投入大，市场发育成熟，政府大力扶持引导加行业协会的规范自律，使浙江省在铁皮石斛行业内积累了显著优势，占全国产业链70%以上的权重。特别是近10 a，铁皮石斛单一品种的产业规模一举超越传统的“浙八味”，雄踞浙江中药材产值榜首。

铁皮石斛属多年生作物，种苗一次投放可多年采收。2013—2014年，种苗需求由新增种植的增量市场转入原有种植基地部分替换更新种苗的存量市场，种苗需求量表现为断崖式下降探底再缓慢回升状态。种植户收益被压缩后，对种苗价格的接受能力也显著降低，种苗出厂单价塌落至高峰时期的1/5。铁皮石斛组培育苗[1-3]作为劳动密集型行业，因劳动力成本急剧上升和频繁遭遇用工紧缺，进一步压缩了育苗企业的利润空间，多因素累加使行业内育苗工厂陷入严峻境地。提升育苗效率、缩短培养周期、减少劳动力消耗、降低单位苗产量的能源消耗及培养库容和资本占用及大幅压缩种苗生产成本是眼下铁皮石斛育苗的急迫需求。基于以上需求，开展了铁皮石斛无菌悬浮培养育苗工艺开发测试。

1 材料与方法

1.1 材料

开发试验种源材料取自杭州余杭区铁皮石斛种植基地。选取雁荡山红杆品系的铁皮石斛4 a生植株为亲本，采用人工授粉生成果荚，成熟后取蒴果内种子进行无菌育苗扩繁。

1.2 方法

1.2.1 人工授粉育种源

于5月下旬盛花期，选取健壮铁皮石斛4 a生盆栽植株，分别标记为母本组和父本组。母本组植株上选取营养供应旺盛的花朵，用接种针去雄，眼科镊夹去唇瓣，其他花朵和花苞全摘去。父本组植株上选优势花朵，用接种针剥去药帽，暴露花药，用接种针尖挑起花药送入母本组植株已处理花朵的蕊柱腔内黏液区，黏住花药即可。完成授粉后的母本植株单独隔离培养，以免沾染其他花药引起串种。以此方法分别完成同花授粉、同株异花授粉、同品种异花授粉、不同居群异花授粉4组样本的人工授粉。授粉次日即可见花瓣开始凋萎，5日后可观察到子房膨大，完成坐果。

1.2.2 取种及预处理

授粉后150 d，蒴果发育成熟，摘取饱满果荚，于正压无菌层流罩下做蒴果整体无菌化处理。用纯净水清洗果荚后，采用吐温-80和脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠(AES)稀释液分别振荡浸泡3 min完成表面浸润。完成表皮浸润的蒴果分别转入2%次氯酸钠、0.5%高锰酸钾、0.5%升汞、70%乙醇溶液中振荡浸泡10 min，之后用无菌水清洗去除果荚表面残留杀菌剂。处理后果荚置于无菌培养皿中。后续测试中比较2种表面活性剂以及4种杀菌剂用于蒴果无菌处理的效果。

1.2.3 种子提取及悬浮液制备

在严格的无菌操作环境中，用解剖镊剥开果荚，将果荚内含粉状种胚撒入预装有80 mL无菌水的玻璃锥瓶内，密封锥瓶后，置于摇床上振荡，使粉末状种胚从营养支撑纤维上脱落，分散于无菌水中，同时成团种胚受晃动水力冲击，分散成均匀悬液。

(1)2000年运营指南中学习工具的领域名称以“计算机”为主，2005年使用了“信息”一词，更加强调信息技术教育代替计算机运营技术的优势；2015年，用“信息文化”一词来凸显信息通信技术教育的内涵——从信息的特点延伸到信息道德，体现了人类文明逐渐发展的形态。

1.2.4 悬浮培养

在5升容量的玻璃发酵罐内，灌注2 L的N6全配方无菌培养液[4]，pH 5.8，控制培养液温度25±2 ℃。在正压层流罩保护下，用无菌注射器抽取前述锥瓶内制备的无菌种胚悬液注入发酵罐内，完成发酵罐接种。将发酵罐本体整体移入光照培养箱内，箱内分别用色温4 500 K和6 300 K白光，采用12和24 h不同时长照明[5]，光照度800 lx，测试光照色温和时长对种胚球茎发育的影响。开启罐内空气循环和罐底电磁搅拌。连续培养20 d后，罐底取样口加装无菌微孔过滤器，负压抽排出N6培养液，截留培养物种胚球茎于发酵罐内。通过补料口注入灭菌后制备的B5+NAA 0.3 mg·mL-1培养液3 L，进入悬浮增殖培养，此阶段培养过程中，需每2 d通过换气阀注入过滤除菌后的无菌空气进行培养罐内气体更换。持续培养20 d后，罐体内悬浮液呈现整体浅绿色，经过增殖后的种胚球茎充满培养液。其间取样，将培养液滴注于96孔板内，解剖镜下清点计数培养液含种胚球茎微粒密度和单体直径。种胚球茎密度超过200粒·mL-1后，用于下阶段固态培养基上无菌播种。

1.2.5 种胚球茎无菌播种

参照文献[6]。以1/2B5+1/3 MS+5%椰子胚乳提取液+3.2%蔗糖+4.5‰琼脂制备增殖分化培养基，调整pH值为5.8，分装培养瓶后经过121 ℃蒸汽保温保压15 min灭菌，冷却固结后即可进行种胚球茎播种。在发酵罐内导入过滤无菌空气，维持罐内微正压，开启发酵罐磁力搅拌保持培养悬浮液均质状态，在严格无菌操作环境中，通过取样口连接医用输液胶管，向每个培养瓶注入1 mL种胚球茎悬浮液，用微孔滤膜透气盖封口后，摇匀使种胚球茎细微颗粒均匀分散平铺于培养基表面。

1.2.6 球茎增殖分化及种苗建株培养

完成种胚球茎无菌播种的培养瓶，静置于光照培养架上，保持培养温度25±2 ℃，不间断给予800～1 000 lx照度6 300 K色温顶照光[7]，促使播种后的种胚球茎完成增殖扩增后快速建立极性，10～15 d即可观察到种胚球茎数量呈5～8倍的增长，并建立极性，顶端颜色加深，萌发芽尖端，球茎底部接触培养基侧膨大，萌发根原基。继续静置培养40 d，可获得苗高10～15 mm、直立向上、一致性优良、根系交叉少、密度分布均匀的铁皮石斛无菌原种苗。

1.2.7 生根和壮苗培养

将上一步骤获得的原种苗，换瓶接种至2/3 MS+7%香蕉提取液+3.5%蔗糖+4.2‰琼脂的生根壮苗培养基中，于人工光照下培养至苗高40±5 mm后，整批次移瓶至控温日光温室中继续培养[8]，使石斛苗适应自然光谱和光周期。待苗长至60～80 mm高、茎秆直径3 mm以上、单苗3条以上根、根长30 mm以上、顶部两叶片V形张且叶色加深时，即可用于商品苗出售或温室驯化炼苗种植。

2 结果与分析

2.1 人工授粉环节亲本选取对育苗全过程的影响

表1 不同授粉方式对育苗过程及幼苗质量的影响

2.2 不同方法取种预处理方法的选择及效果评估

测试比较2种浸润剂和4种杀菌剂浸泡处理蒴果后，培养过程中的菌类污染情况，统计增殖分化阶段有害菌感染表现情况。由表2可知，在蒴果无菌处理环节，采用吐温-80预浸润+0.5%氯化汞浸泡可获得可靠的无菌种胚。

表2 不同杀菌剂的效果评估

2.3 发酵罐悬浮阶段培养

培养罐无菌空气持续导入有利于种胚球茎增殖及细胞分化能力获得。悬浮培养全程保持罐底120 r·min-1磁力搅拌是维持种胚细胞团在培养液内均匀悬浮分布的必要条件。4 500 K暖白光和6 300 K正白光2种色温的光照对于种胚球茎的扩增影响差异不显著。

表3 不同光照时长对铁皮石斛种胚悬浮培养的效果

由表3可知，悬浮培养阶段，24 h不间断光照能显著缩短种子转绿时间，加快种胚细胞团增殖，所得种胚包含细胞数量多，营养积累量大，发育程度好，有利于后期更快进入分化建株，缩短整体育苗时间。

球茎播种入瓶后的分化培养阶段，6 300 K的高色温的光照能促进种胚发育进入分化建株。垂直于培养基表面800～1 000 lx的不间断顶照光是促进球茎发育，获得整齐一致分化苗的重要条件。

2.4 百万苗批量中试实测各细分阶段指标对比分析

新开发工艺相对于传统玻璃瓶固体培养基工艺，在每百万苗批次铁皮石斛无菌育苗中试生产中，各细分阶段生产实测数据如表4所示。

表4 新工艺和传统工艺各细分阶段分析

由表4可知，新开发工艺在初始阶段引入发酵罐进行悬浮培养扩增种胚球茎，以及由此衍生出前后段配套改进，从全程培养时间缩短、扩增倍数大、库容占用减少、接种用工量减少、降低育苗能耗、换瓶操作种苗损伤小、种苗一致性好等方面优于传统玻璃培养瓶固体培养基上起始播种流程。

3 小结与讨论

本次铁皮石斛无菌悬浮培养育苗工艺开发过程，经过4个铁皮石斛育苗季中试规模育苗生产实践检验和逐步完善，初步具备实际生产应用价值。新工艺借助发酵罐内悬浮培养，初期种胚萌动及增殖过程中培养物全程浸泡于全营养配比的培养液中，培养物得到营养的饱和供给，且代谢废物能及时排出至培养液中，培养过程中实现培养液的无菌更换，避免自身代谢废物积累毒害导致生长抑制；分化建株培养时球茎悬浮液滴加分瓶播种的方法革新，替代了传统工艺接种铲挖取后平铺球茎颗粒的操作，播种后的种胚球茎无须经历损伤修复休眠期即可进入芽萌发阶段，实现种胚在培养过程中生长的连续性。140～180 d的全程育苗时间是传统工艺的一半时长，10月铁皮石斛蒴果成熟取种，经过5～6个月的培育成苗过程，商品苗批量出瓶高峰在次年第二季度，正好是浙闽赣一带行业集中产区铁皮石斛苗定植最佳季节，相比较传统工艺于次年秋季到来的出苗高峰，新开发育苗工艺更好的衔接了种植用苗需求，使大田种植石斛苗有充足时间经历当年暖季的生长期，完成适应种植环境的生理过度，提升第一个越冬季植株抗冻能力，解决了瓶苗脱瓶炼苗种植初期严重的低温冻害难题，降低种植保温设施要求和养护成本，由此可缩短近一年的种植时间，种植户提前可产出铁皮石斛成品药材。

新开发工艺实现了育苗培养初期培养条件的均一可控，种胚球茎发育一致性好，结合培养基成分的调控，删减人工换瓶操作次数，种苗发育过程中受到的转接损伤少，有效改善了转接过程苗损伤导致的顶芽休眠诱导侧芽萌发造成商品苗规格参差不齐，显著提升商品苗的品质。

在生产过程中，新开发工艺种苗萌发一致，换瓶接种操作时避免了必须在无菌操作条件下繁琐的规格分选过程，转接效率得以提高，单位产苗的用工量降低。操作的简化，附加带来转接污染率的减低，也降低了生产线操作员工的培训难度。育苗周期的压缩，降低了组培育苗工厂光照及控温能耗，同时使育苗工厂能在夏季到来前基本腾空铁皮石斛瓶苗对恒温光照培养室库容占用，释放的生产能力可快速转移至草莓、小薯、菊花等秋冬季种植作物脱毒苗的繁育业务。在降低石斛种苗生产成本的同时拓展了业务收入，多元化生产亦增强育苗企业的抗风险能力。

本次基于铁皮石斛无菌悬浮培养育苗工艺的开发改进，降低了铁皮石斛种苗生产成本，增强了种苗的市场竞争力，提升了育苗生产企业在销售时的议价能力，也为其他物种育苗开辟新通道。