不同产地桑叶中黄酮类成分含量分析

张宪，李岳

(北京市药品检验所 仪器检测中心， 北京 102206)

桑树在我国南北各地均有广泛种植，因此桑叶的产量极为丰富。桑叶为桑科(Moraceae)桑属落叶乔木或灌木桑(MorusalbaL.)的叶，含有黄酮类、多糖类、生物碱类、氨基酸类、香豆素类、维生素类、脂类、矿物质等诸多化学成分[1-2]。中医药学认为桑叶具有疏风散热，清肺、肝的作用，可以用于治疗风热型感冒、肺热型咳嗽以及头晕、头痛、眼花等，此外还具有降血压、血脂、血糖，预防心肌梗塞等功效，可直接抑制凝血、降低心率，促使血压下降[3-4]。桑叶对糖尿病及其并发症的疗效已得到医学界的广泛认可，并且已知桑叶中发挥降糖效果的主要化学成分即为黄酮类[5-6]，此外，桑叶提取的黄酮类成分在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、提高免疫力等诸多方面起到重要的作用。本研究选取了河南商丘、湖北襄阳、湖南邵阳、浙江桐乡、江苏泰兴、四川绵阳、安徽亳州、广西玉林等8个产地的桑叶，采用高效液相色谱法(HPLC)测定了不同地区桑叶中黄酮成分的含量，为桑叶的采集与药理作用开发提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究选取我国8个省份不同地区的桑叶，总共分为22个批次，经鉴定所有药材均为真品。 桑叶产地来源详见表1。

表1 桑叶药材样品来源

1.2 仪器与试剂

1200型HPLC仪(美国安捷伦科技公司)；1001型旋转蒸发仪(上海安谱科学仪器有限公司)；毛蕊异黄酮苷和毛蕊异黄酮对照品(上海纯优生物科技有限公司)，槲皮苷、芒柄花苷、异槲皮苷以及芒柄花素的对照品(北京万佳首化生物科技有限公司)，上述对照品的纯度均大于98%；试剂乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.3 研究方法

1.3.1 色谱条件及溶液制备

紫外检测器，Sepex C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为360 nm，流速1.0 mL/min，进样体积10 μL，柱温30 ℃。取适量的桑叶干燥后进行粉碎，精确称量3.0 g粉末放入容器中，加入体积分数60 %的乙醇100 mL，90 ℃水浴1.5 h，回流提取，减压浓缩后取出溶液，冷却后称重过滤(0.45 μm 微孔滤膜)[7]。

1—槲皮苷；2—毛蕊异黄酮苷；3—毛蕊异黄酮；4—异槲皮苷；5—芒柄花苷；6—芒柄花素。图1 样品及混合对照品的高效液相色谱图Fig.1 HPLC of the sample and mixed reference substance

混合对照品液的配置：分别精密称取适量的毛蕊异黄酮苷、槲皮苷、芒柄花苷、异槲皮苷、毛蕊异黄酮以及芒柄花素6种对照品，用乙醇溶解后定容至50 mL，振荡均匀，制备对照品浓度分别为0.204 1、0.785 4、0.174 6、0.153 6、0.026 4、0.032 9 mg/mL的混合对照品溶液[8]。样品及混合对照品的高效液相色谱图见图1。

1.3.2 线性范围试验验

取上述配备的对照品溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2 mL，使用甲醇定量至10 mL，用 0.45 μm微孔滤膜过滤后作为对照品溶液B，然后取B溶液1 mL，甲醇定容至5 mL作为溶液C，高效液相色谱条件下分别测定混合对照品溶液(5 μL)、溶液B(10 μL)和溶液C(10 μL)的峰面积的相对标准偏差(RSD)。

1.3.3 精密度试验

称取适量桑叶样品，按照1.3.1项下方法制备供试溶液，取适量对照品混合溶液，按照色谱条件，连续进样6次，同时记录峰面积RSD。

1.3.4 稳定性试验

取1.3.1中制备的供试品溶液，分别测定 0、2、4、8、10、12 h各种成分的峰面积RSD[9-10]。

1.3.5 重复性试验

取同一批次已知总黄酮含量的桑叶样品6份，每份3 g，按照1.3.1项下方法制备供试品溶液并进行色谱分析，利用建立的标准曲线分别计算各供试品溶液中各成分含量[11]。

1.3.6 加样回收率试验

精密称取不同省份产地测定后的桑叶样品，每个产地称取6份，每份0.5 g。不同产地样品均精密加入含毛蕊异黄酮苷24.21 μg/mL、槲皮苷 229.2 μg/mL、芒柄花苷241.4 μg/mL、异槲皮苷58.78 μg/mL、毛蕊异黄酮65.03 μg/mL、芒柄花素245.61 μg/mL的混合对照品溶液10 mL[12]，按照1.3.1项下方法制成供试品溶液，分析计算回收率。

1.3.7 样品含量测定

分别精密称定不同产地桑叶粉末2.0 g，按1.3.1项下方法制备供试品溶液和测定峰面积，并用外标法计算样品中6种黄酮的含量[13]。

2 结果

2.1 回归方程及线性关系分析

分析不同产地桑叶的质量分数及峰面积，以进样量标记为横坐标(X)，各成分峰面积标记为纵坐标(Y)，其回归方程及线性范围结果显示桑叶中提取的6种黄酮类成分在线性范围内与峰面积线性关系良好(表2)。

表2 6种黄酮类化合物的回归方程及线性范围

2.2 精密度试验结果

精密度试验结果显示6种黄酮类成分的峰面积RSD分别为毛蕊异黄酮苷0.24%、槲皮苷0.36%、芒柄花苷0.56%、异槲皮苷0.29%、毛蕊异黄酮0.33%、芒柄花素0.16%，表明本研究检测仪器的精密度符合要求。

2.3 稳定性试验结果

稳定性检测结果显示，桑叶提取的6种黄酮类成分的峰面积RSD分别为毛蕊异黄酮苷0.13%、槲皮苷0.37%、芒柄花苷0.24%、异槲皮苷0.41%、毛蕊异黄酮0.44%、芒柄花素0.25%，表明供试品溶液12 h内能够基本保持稳定，其稳定性良好。

2.4 重复性试验结果

重复性试验结果显示，样品中毛蕊异黄酮苷、槲皮苷、芒柄花苷、异槲皮苷、毛蕊异黄酮以及芒柄花素的平均含量分别为1.848 0%、0.373 0%、0.153 0%、1.446 0%、0.217 0%、0.006 3%，重复性试验的RSD值分别为1.83%、1.77%、1.14%、2.16%、1.75%，结果表明试验检测结果的重复性良好。

2.5 加样回收试验结果

不同产地6种黄酮类成分的平均回收率分别为毛蕊异黄酮苷99.61%、 槲皮苷96.05%、芒柄花苷99.98%、异槲皮苷97.97%、毛蕊异黄酮99.30%、芒柄花素96.42%；RSD 分别为 0.34%、2.17%、0.68%、0.31%、0.48%、0.71%。表明检测方法的准确度良好。

2.6 样品的黄酮类成分含量测定结果

检测结果显示，安徽亳州、四川绵阳、广西玉林地区采集的桑叶中黄酮总量较高，其次是河南商丘、浙江桐乡、江苏泰兴、湖北襄阳、湖南邵阳桑叶的总黄酮量最少，提示不同省份各产地桑叶的黄酮含量差异明显，详细数据见表3，其中，相同产地取不同批次的黄酮类成分的平均含量。

表3 不同产地桑叶中6中黄酮类成分含量测定结果(n=6)

3 结论

本研究采用高效液相色谱法分析检测我国8个省份不同产地的桑叶中6种黄酮类成分含量。结果显示，桑叶中所含的黄酮总量，以四川绵阳、安徽亳州、广西玉林地区较高，其次是河南商丘、浙江桐乡、江苏泰兴、湖北襄阳，而湖南邵阳桑叶的黄酮总量最少。提示在选择桑叶作为中药材时，可酌情根据黄酮类化学成分对不同疾病的疗效，进而选择不同省份的桑叶产品。不同品种和不同产地的桑叶中黄酮类成分含量的差异可能既受到生长环境、桑叶位置、采摘时间等外部因素的影响，也与品种的差异等内部因素有关[14]。桑树中黄酮类化合物的含量多少与桑树的抗逆性呈现相关性，其中抗逆性强的桑品种的桑叶中黄酮含量明显较高[15]。总之，本研究提示高效液相色谱法测定桑叶中黄酮类成分的含量具有操作简单、稳定性佳及重复性好的特点，不同产地采集和生产的桑叶药材中各类黄酮成分及总量均有差异。