4例先天性胆汁酸合成障碍2型患儿的临床特征及遗传学分析

姜 涛， 欧阳文献， 谭艳芳， 唐 莲， 张 慧， 李双杰

湖南省儿童医院 肝病中心， 长沙 410007

先天性胆汁酸合成障碍2型(congenital bile acid synthesis disorder type 2，CBAS2)是醛酮还原酶家族1D1(Aldo-ketoreductase family1 member D1，AKR1D1)基因突变引起△4-3-氧固醇-5β-还原酶缺乏所致的胆汁酸合成障碍性疾病，其主要临床表现为新生儿胆汁淤积症和暴发型肝衰竭[1]。自1988年Setchell等[2]根据血尿FAB-MS分析首次诊断2例△4-3-氧固醇-5β-还原酶缺陷患儿后，有关CBAS2的病例报道仅数十例[3-4]。现对收治的CBAS2患儿临床特征、转归以及AKR1D1基因变异进行了分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2017年1月—2020年11月本院肝病中心诊治的4例CBAS2患儿病例资料，其中男2例，女2例。

1.2 基因检测及分析 在父母签署知情同意书后，抽取患儿和父母外周静脉血2 ml，提取合格的人类基因组DNA进行文库制备。文库制备是将基因组DNA打断成主带<500 bp，峰值在350 bp的小片段DNA，将打断后的DNA片段进行末端补平，在3′端加“A”碱基，使得DNA片段能与5′端带有“T”碱基的特殊接头连接，经Pre-Capture LM-PCR对带有接头的文库进行扩增。等量混合文库后，加入人类外显子文库进行杂交，捕获Exon capture区域，再通过PCR扩增富集捕获后产物。琼脂糖凝胶电泳测定文库的片段大小，Qubit3.0及荧光定量PCR测定文库的浓度。将质检合格的文库稀释至上机浓度，使用IlluminaHiseq测序平台进行测序分析，测序结果通过生物信息学方法进行数据分析，后由遗传咨询师进行报告解读。

检索内部数据库、dbSNP、ESP6500、ExAC等人群数据库，标注单核苷酸多态性和低频良性变异。对患儿父母及主要亲属相应突变外显子进行PCR测序，以明确突变来源。应用预测软件对变异的保守性/致病性/危害性进行预测。检索HGMD、PubMed、Clinvar、OMIM等数据库中的变异相关文献，分析文献内容，参考美国医学遗传学和基因组学学会变异分类指南，对变异进行分类。

1.3 伦理学审查 本研究方案经由湖南省儿童医院伦理委员会审批，批号：KY2020-06。

2 结果

2.1 临床特点和预后 4例CBAS2患儿均以皮肤黄染为首发表现，确诊年龄为3～5月龄，病例2父母为近亲结婚。所有患儿均有肝大、浅黄色大便表现，病例1伴有生长发育迟缓和脾大，实验室检查提示：胆汁淤积，转氨酶升高，凝血全套、Alb和TBA正常(表1)，2例患儿伴有脂溶性维生素(A、D、E)缺乏，腹部彩超提示肝大、小胆囊和肝实质弥漫性病变。

表1 4例CBAS2患儿入院后初次肝功能指标检查结果

患儿入院后予以护肝、熊去氧胆酸(10～15 mg·kg-1·d-1)利胆等治疗后，胆红素仍反复升高，甚至进行性加重。病例3于8月龄时因肝硬化失代偿而死亡。病例1、2和4予以熊去氧胆酸治疗数月后，改为鹅去氧胆酸(5～10 mg·kg-1·d-1)治疗，电话随访病例1(3岁8月龄)和病例4(2岁)患儿肝功能一直正常(黄疸消退时间不详)，病例2(6月龄)患儿在使用鹅去氧胆酸治疗1个月后胆红素恢复正常，转氨酶仍有轻度升高。3例患儿的生长发育均达标，但其远期预后需定期随访。

2.2 家系基因分析结果 基因分析结果显示，3例复合杂合突变，1例纯合突变，共5种变异(表2)，其中c.797G>A和c.580-13T>A已在多个病例中报道[3,5]，而c.70G>C、c.93+2T>C和c.579+2_579+4delinsA这3种新变异在PubMed、OMIM、HGMD、Clinvar等数据库及文献中未见报道，且在正常人数据库(dbSNP、ESP6500和ExAC等)中未见收录，表明不是人群多态性位点，结合临床表现，软件预测提示为致病或可能致病。

表2 4例CBAS2患儿基因变异情况

3 讨论

胆固醇在肝细胞内经过一系列的酶促反应后形成胆汁酸，其合成过程中至少有16种酶参与，任何一种酶的缺乏均可导致正常胆汁酸生成障碍，从而引起先天性胆汁酸合成障碍，该类疾病均为常染色体隐性遗传病。患儿因肝细胞内不正常的毒性胆汁酸堆积、正常胆汁酸生成减少等而致胆汁淤积、肝衰竭和肝硬化[1,6]，同时可出现脂肪和脂溶性维生素吸收障碍等，占儿童胆汁淤积性肝病的1%～2%[7]，最常见的为CBAS1和CBAS2[7]，早期初级胆汁酸的治疗可明显改善患儿临床症状，减少肝移植[8]。

CBAS2是由于胆汁酸合成过程中的△4-3-氧固醇-5β-还原酶缺乏，导致其底物转化为7α-羟3-氧-4-胆烷酸、7α、12α-双羟-3-氧-4-胆烷酸、异鹅去氧胆酸和异胆酸，经结合形成含3-氧-△4结构的不典型胆汁酸，进入血液后通过肾脏排出体外[2]。CBAS2患儿最常见的临床表现为新生儿胆汁淤积，其他表现为：黑尿、白陶土样便、脂肪泻、脂溶性维生素缺乏、肝大、生长发育迟缓等，无明显瘙痒症状[9]。生化检查可见高结合胆红素血症，转氨酶增高，GGT轻度升高或正常，TBA正常，凝血功能异常等。肝脏病理检查可见胆管排列紊乱，肝巨细胞样变及肝细胞内胆汁淤积、纤维化、假小叶形成，伴或不伴髓外造血[10-11]。本研究中患儿以胆汁淤积和肝大为主要表现，部分患儿伴生长发育迟缓、脾大和脂溶性维生素缺乏。生化指标提示胆汁淤积，AST水平升高幅度大于ALT，TBA正常，与文献[3]报道一致。病例2为纯合突变患儿，但其临床症状并不比复合杂合突变患儿重，与Drury等[12]报道不一致。值得注意的是，4例患儿在予以熊去氧胆酸治疗后，TBA和GGT可出现一过性升高，TBA最高可达346.7 μmol/L，GGT可达337 U/L。因此，对于曾使用熊去氧胆酸治疗的患儿，TBA和GGT的一过性升高可能导致临床上的误诊或漏诊，需反复多次监测GGT和TBA的变化。同时需与低GGT型胆汁淤积性肝病如进行性家族性肝内胆汁淤积症[13]、关节畸形-肾小管功能不全-胆汁淤积综合征和良性复发性肝内胆汁淤积症等遗传性疾病鉴别，若患儿GGT和TBA均正常，则需考虑先天性胆汁酸合成障碍。

临床上高度怀疑CBAS2的患儿，可进行尿液胆汁酸谱分析，注意避免在肝衰竭或严重肝损害时进行，需结合AKR1D1基因检测[10-11]明确。AKR1D1基因定位于7号染色体q32～33区，含有9个外显子，全长42 kb，在肝脏中高度表达，其编码含有326个氨基酸的△4-3-氧固醇-5β-还原酶，除了参与胆汁酸合成，还参与调控多种CYP家族酶类表达[12]，在类固醇激素的降解代谢中起一定作用。目前报道的基因突变为：c.797G>A、 c.919C>T、 c.158A>G、c.396C>A、c.722A>T、c.622C>T、 c.385C>T、 c.467C>G、 c.850C>T、 c.737G>A、c.217C>T、c.853C>T、c.580-13T>A、c.64G>A、c.580-13T>A、c.579+2T>-、c.919C>T、c.587delG、c.579+2delT、c.579+4delC、c.933delG和c.511delT等。以错义突变为主，此外还有无义、缺失和剪切位点突变[14-15]。本研究中基因检测发现，患儿均有AKR1D1基因突变，3例复合杂合突变，1例纯合突变，共5种突变，c.797G>A和c.580-13T>A为已知致病突变[3,5]，60%(c.70G>C、c.93+2T>C和c.579+2_579+4delinsA8)的新突变主要为错义突变(2/5)和剪切位点突变(3/5)。错义突变c.70G>C，蛋白质结构预测可能有害；经典剪切位点突变c.93+2T>C，生物危害性较高；c.579+2_579+4delinsA该变异位于mRNA剪接区域，核苷酸序列高度保守，并且多种计算辅助算法均预测此变化可能会影响蛋白功能。结合患儿的临床表现和家系分析，可诊断为CBAS2。

鹅去氧胆酸为人体必需的初级胆汁酸，可通过负反馈机制抑制CYP7A1表达，下调异常胆汁酸的合成，减少其对肝细胞的毒害作用。大量文献报道，熊去氧胆酸对CBAS2患儿治疗效果欠佳，而鹅去氧胆酸可有效缓解临床症状，避免进展性肝损害。临床上对于口服药物治疗效果欠佳或者肝衰竭、肝硬化者，可考虑肝移植。本研究中4例CBAS2患儿初期予以熊去氧胆酸治疗，效果欠佳，其中1例患儿8月龄时死亡，3例患儿在使用鹅去氧胆酸治疗后胆红素恢复正常，与文献[16]报道一致。对于合并脂溶性维生素缺乏的患儿可予以补充脂溶性维生素，同时应警惕糖皮质激素的应用，因其可下调AKR1D1的表达和活性。此外，AKR1D1的下调改变了多个核激素受体的激活，以驱动葡萄糖生成和糖原合成基因表达谱的变化，这可能加剧外源性糖皮质激素的不良影响[17]。

总之，临床上对于高度怀疑CABS2的患儿应进行基因检测或者尿液质谱分析，早期诊断并尽早应用鹅去氧胆酸可明显改善临床症状，减少肝移植发生率；同时本研究中3种AKR1D1基因新变异的识别丰富了AKR1D1基因谱。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：姜涛负责课题设计，资料分析，撰写论文；谭艳芳、唐莲、张慧参与收集数据，修改论文；李双杰、欧阳文献负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。