黄盖鲽活体种质资源保存关键技术研究

文/李秀梅 张宁 李丁军 齐鲁 于文松 王田田

为建立优良的黄盖鲽活体种质资源库，本团队开展了黄盖鲽活体种质资源保存方法、活体种质库管理技术路线及质量控制措施等方面的研究，采用室外围堰保种池和室内养殖池接力的方式，低碳高效，创新了活体种质资源保存方式，节约了生产成本。

黄盖鲽（Pseudopleuronectes yokohamae），属鲽形目、鲽科、黄盖鲽属，其肉质细嫩、营养价值高，是我国黄海、渤海海域鲆鲽类中重要经济品种之一，渔期多在每年的5月份和8月份。然而近些年由污染的生态环境、不合理的捕捞等因素引发黄盖鲽种质退化等一系列问题，使得黄盖鲽优良种质资源的保护成为鲆鲽鱼养殖业中亟需解决的问题。为了保护野生渔业资源，我国在山东省蓬莱市近海海域设立了蓬莱牙鲆黄盖鲽国家级水产种质资源保护区，保护区主要保护对象为钝吻黄盖鲽（俗称“地生子”）等经济鱼类。此外，2013年12月30日，原农业部正式批准对“蓬莱地生子”实施国家农产品地理标志登记保护。近年来，黄盖鲽养殖产量占鲆鲽类鱼类增养殖产量的比重越来越大，其价值和效益不断提高，在国内水产品市场、国际贸易市场中占有重要地位。

《中共中央国务院关于全面推进乡村振兴加快农业农村现代化的意见》即2021年中央一号文件明确提出：农业现代化，种子是基础，要求打好种业翻身仗，更好地保护、挖掘、研究和利用种质资源，提高种业发展基础性公益性服务能力。水产种质资源是遗传改良、苗种培育和水产养殖业等可持续发展的重要物质基础。黄盖鲽野生资源的高效利用、收集与保护等工作的开展，既是产业发展的迫切需要，也是推进生态文明建设和促进人与自然和谐发展的重大举措。本试验对黄盖鲽活体种质资源保存关键技术进行研究，以期为黄盖鲽种质资源库的建立及种质的长期保存、人工育种繁殖提供理论基础。

一、试验地点及设施

本研究试验于2013年7月至今在国家级山东蓬莱黄盖鲽原种场内进行，该场位于蓬莱海域，附近无陆源污染。原种场基地拥有工厂化育苗与养殖车间3800m2，其中苗种车间4000m2（有效育苗水体面积3200m2），原种培育车间1000m2，亲鱼培育及良种选育车间2000m2；露天保种池2个，共30hm2。场区内各类育苗养殖配套设施齐全，饵料培育车间2000m2，饵料加工冷库（600t）一座，水、电、气、暖系统完备。

二、材料与方法

（一）获取野生种质资源

黄盖鲽野生群体全部来自蓬莱牙鲆黄盖鲽国家级水产种质资源保护区。采捕种鱼时要采用质地柔软（尼龙线）、小网目（小于5cm）的定置网具捕捞，装鱼容器的内壁要光滑，严防其体表受伤。选取身体肥满、体色正常（鲜艳，无白化）、鳞片和鳍膜完整、健康无病，雌鱼2龄以上，体重800g以上，雄鱼2龄以上，体重400g以上的个体。运输时要充气，并尽量缩短运输时间。种鱼群体的雌雄比例可按3:1～4:1。对选好的种鱼群体进行种质检测，保证其遗传基因的纯合度符合物种标准。

（二）建立野生种质资源保存方法

种质资源保存环境及质量控制方法见图1。

图1 种质管理技术路线图

1.露天保种池保种

将筛选合格的野生种鱼放置于露天保种池内进行驯化和保存。保种池平均水深2m，底质为沙底，投放种鱼前彻底清塘翻底消毒，然后调入自然海水。保种驯化期间投喂鲜活小杂鱼虾，每日换水量10%～20%，溶解氧控制在6.5mg/L～8.5mg/L之间。

2.车间内保种

经过露天保种池培育的种鱼采用定置网具收获后放入水泥池，开展黄盖鲽室内人工繁育。种鱼培育池尺寸为5m×5m×1.2m，池底排水孔处安装一水流调节器及水流循环管道。管道双层内径分别为20cm和14cm，高1 6 5 c m，水流流速调节在2 0 L/min～48L/min。培育期间，间断性充气，气石分布于近底层。其它各项环境因子包括：水温12℃～15℃，盐度30～33，pH7.7～8.6；溶解氧6mg/L以上。种鱼投放密度为2尾/m2～3尾/m2，♀:♂=3:1。

（三）日常管理

定时监测各项环境因子，维持各项因子在最适范围内。保持水体循环流动，每天换水率90%以上，水体透明度以看清池底为宜，清除残饵、污物，除去死鱼。新鲜海水注入前检查种鱼成活率，观察其性腺发育程度及摄食情况并做好记录。每日投饵2次，保证饵料供应充足。饵料投喂量约为鱼体重2%～3%，饵料种类以鲜杂鱼和人工配合饲料为主。

（四）种质的保存隔离

1.专池培育

不同批次、不同来源的黄盖鲽亲本分池养殖，单独操作，进排水系统相对独立，防止混杂；黄盖鲽原种池与生产用种池独立分区，并同其他区严格隔离；黄盖鲽保种池和亲本养殖池所需的水源必须经过多级砂滤，以避免非亲本黄盖鲽或其它鲽类的遗传污染。限制无关人员和不洁工具的进入，工作人员要经过消毒程序才能进入种鱼车间；使用的工具应全新，不能借用、混用其它车间工具；亲鱼通常只能输出，不能随便输入。

2.加强培育管理

种鱼的培育管理工作需严格把关。种鱼所用人工配合饲料应符合NY5052-2001规定，使用药物应符合NY5071-2002规定，防止因饲料或药物使用不当而造成优质原种基因变异。对每批次野生鱼的采捕时间、地点、规格、成活率等信息建立档案；养殖过程中的投饵、用药记录以及水质分析记录等资料同时存放于档案之中。

3.日常管理

维持各环境因子在适宜范围内，避免因环境不适而造成黄盖鲽出现应激反应；每日检测环境常规指标，保持环境优良而稳定；检查饵料投喂的各环节；保证车间环境卫生等。吸污清底采用自主研发的养殖池手持吸底器，在长方形下底板的前后端分别设置驱鱼支架，提前驱赶周围的种鱼，减轻对种鱼的伤害。提前预防控制疾病的诱发因子，坚持防大于治的原则，保证种鱼健康生长。

4.种质监测

监测和评价指标包括：生物学性状、个体大小、形态学特征、繁殖习性和生长；生态学特征包括对环境的适应性和抗逆性；遗传学特征包括细胞（染色体）、蛋白质（酶）和DNA水平遗传特征。

5.病害预防

合理利用已批准的水产养殖用兽药中的抗菌药、消毒药防病，同时增强种鱼免疫力。禁止使用禁用抗生素及违禁药物，可以采用已批准的水产养殖用兽药中的中药材、中成药。提倡使用国标水产用兽药杀菌消毒。对培育过程中出现的死亡个体进行解剖，及时分析致病因素和制定有效防治措施，并做好《病害检测记录》。

（五）管理制度建设

为了保证种质质量，黄盖鲽活体种质库研发技术中心特制定了一系列质量保障体系和质量控制措施，对整个过程严格监管。

1.质量保障体系

黄盖鲽活体种质库建立了三个质量保障体系：即标准化生产体系、疫情防控体系和产品质量控制体系。标准化生产体系首先确定了应用于生产的国家、行业标准，同时制定了黄盖鲽养殖技术规范的企业标准，从而实现了黄盖鲽活体种质库整个生产过程的标准化管理。疫情防治体系包括设立鱼病检测室和防疫专员，从而能快速、及时发现疫情，在疫病发生初期立即采取相应措施。产品质量控制体系体现在黄盖鲽活体种质库配备专职的质量管理员，并把质量控制延伸到生产的每个阶段。

2.质量控制措施

（1）药物控制措施

原种保存及培育中，做好养殖过程中药物使用的登记备案制度，对药物的采购、储存、领取和使用的种类、数量、时间等实行全面监督，每一步都要记录、签字并存档，确保用药的合理性和安全性。在生产中，严格按照NY507-2002规定的准则进行用药，绝不使用国家禁止使用的违禁药品和添加剂。

（2）饲料控制措施

在亲鱼培育、苗种生产和成鱼养殖中所使用的饲料，严格按照NY5072-2002标准进行采购和喂用，拒绝使用腐败变质、生虫以及污染的饲料。饵料鱼应新鲜、无变质、无病害。在饲料中使用的添加剂必须在配方中明确记入，在使用时，还要详细记录生产厂家、生产日期、采购时间、使用数量等，并由操作人员签字备案。

（3）水质控制措施

水质的控制从源头抓起，对水的源头地必须坚持长期监控，平时检测常规指标，每个月进行全面检测。经过沉淀、砂滤等净化处理的海水，在进入培育车间前需每天定时检测水质指标，并记录数据存档，确保养殖用水符合NY5052-2001标准。

（4）严格出场检验制度

首先制定产品出厂程序和方法，对检验判定不符合标准的产品绝不出厂。正常生产时，每年至少进行一次周期性的型式检验。当养殖条件发生变化可能影响产品质量时（如养殖环境的大幅度变化、养殖中发生严重病疫情或对技术路线进行大幅调整等，或者国家质量监督机构提出要求时），对NY5152-2002中规定的全部项目进行型式检验。

产品出售前以同一池作为一批次，休药期结束后，停食24h～36h，按标准要求进行出厂检验和安全指标检验，出厂销售时在包装上标贴产品标签。黄盖鲽出厂检验项目为感官检验，由本公司质检员在车间执行，并将检测结果记录入档。

（六）质量跟踪及种质检测

种质鉴定图谱见图2、图3、图4。对保存的原种定期进行生态环境、形态、生长、生理和遗传性状的种质测定。对售出的苗种进行跟踪调查，掌握其生长和质量状况。通过近5年的养殖效果看，黄盖鲽性状稳定，没有出现种质退化现象。

图2 钝吻黄盖鲽染色体图（2n=48）

图3 钝吻黄盖鲽染色体核型图（2n=48t）

图4 钝吻黄盖鲽异柠檬酸脱氢酶电泳图谱

三、工作成效

本研究建立了黄盖鲽活体种质资源库。近两年黄盖鲽活体种质库共引进保存原始性状的野生黄盖鲽雌性亲鱼1520尾，雄性亲鱼510尾，并从后备亲本中选择个体较大，性状优良的个体雌性1800尾，雄性个体600尾，共计4430尾。2020年经驯化培育、种质检测、筛选后，获得1434尾合格雌性亲本、515尾合格雄性亲本，开展亲本培育共获得优质亲本1733尾（雌性亲本1300尾、雄性亲本433尾），淘汰老化亲本1668尾（雌性亲本1270尾、雄性亲本398尾）。黄盖鲽活体种质资源库现有黄盖鲽亲本保存量6930尾（雌性亲本5200尾、雄性亲本1730尾），后备亲本量5000尾（雌性亲本3750尾、雄性亲本1250尾）。本研究采用室外围堰保种池和室内养殖池接力的方式，低碳高效，创新了活体种质资源保存方式，节约了生产成本。室外围堰保种池驯化暂养是黄盖鲽从自然海区过渡到养殖车间的必要阶段。围堰保种池与大海仅一墙之隔，定期注入自然海水，水质良好，池底铺设沙层，水环境条件更接近自然海区环境。黄盖鲽活体种质资源库的建立，有助于提高山东省蓬莱黄盖鲽品种资源保存和创新利用水平，对培育具有自主知识产权的优良品种，调整优化水产品种结构，加快烟台市资源优势向科技和经济优势转变有重要意义。

四、展望

近两年野生黄盖鲽原种采集难度不断加大，主要表现为采集个体偏小且野生黄盖鲽资源量明显减少，推测是黄盖鲽自然生长速度缓慢再加上过度捕捞等人为因素所致。因此，下一步活体种质资源保存工作重点将会向人工选育优良亲本转移，选择生长速度快、抗逆性强、原始性状明显的优良后代进行亲本培育，并通过不断加大黄盖鲽增殖放流数量来提高海洋资源量。也希望渔业主管部门加强监管，对违规采捕加大处罚力度，切实保护好黄盖鲽野生资源量。此外，就目前完成的黄盖鲽活体种质资源保护工作来讲，还需长期坚持分子层面的种质资源研究。及时开展水产种质资源保存研究，改善收集保存技术手段、建设信息化共享体系、完善共享机制，才能使山东省的黄盖鲽种质资源得到有效地整合和利用，助力我国黄渤海区域渔业经济可持续发展。