咖啡果皮发酵制备乙醇工艺研究

陈 旋，张 航，2，吴 丹，2，杨 延，2

（1.滇西科技师范学院生物技术与工程学院，云南 临沧 677000；2.云南省红茶工程技术研究中心，云南 临沧 677000）

在咖啡初加工过程中会产生大量的果皮废弃物，将咖啡果皮用于生产乙醇，既避免了资源的浪费，又提高了咖啡的附加值。目前，有关咖啡果皮发酵制乙醇的工艺研究报道较少，且乙醇产出率很低。1989年，利美莲等将湿法加工后的咖啡果肉分别用高压灭菌、药物灭菌、蒸煮3种方式进行处理后，再用酵母菌混合菌种进行半固态发酵，酿造咖啡果酒和咖啡白兰地酒，其中咖啡果皮的出酒率为37.6%。2014年，SHamadi等利用酵母菌对咖啡渣进行发酵制备乙醇，发酵产物的乙醇含量为4.7%。文章以临沧咖啡果皮为原料制备乙醇，并对其工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 咖啡果皮

取自云南省临沧市云县幸福镇咖啡厂咖啡豆湿法加工咖啡废弃物，去除果皮中的咖啡豆，密封于温度为4℃的冰箱贮藏。其中粗蛋白（7.31±0.05）%，粗脂肪（2.67±0.04）%，灰分（8.15±0.01）%，水分（61.69±0.07）%，粗纤维（20.44±0.06）%，总糖（18.4±0.05）%。

1.1.2 菌种

白酒曲（安琪酵母股份有限公司生产）。

1.2 试剂

1.2.1 无水乙醇

优级纯（天津市风船化学试剂科技有限公司生产）。

1.2.2 重铬酸钾

分析纯（天津市风船化学试剂科技有限公司生产）。

1.3 仪器与设备

仪器与设备有LDZF 50KB-LLL型立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂生产）、754紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司生产）、TDL-4型台式离心机（上海安亭科学仪器厂生产）、HHS型数显电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产）、ZHWY-211D型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司生产）、PHS-3C型pH计（上海精科有限公司生产）。

1.4 实验方法

1.4.1 稀酸预处理

称取10 g咖啡果皮，按液固比4∶1加入2.50%硫酸，130℃，水解处理60 min，获得咖啡果皮稀酸预处理水解液。

1.4.2 咖啡果皮发酵培养基

将预处理后的水解液进行过滤，收集滤液30 mL置于发酵瓶中，调节pH值为5，在115℃的条件下，灭菌30 min。

1.4.3 咖啡果皮发酵乙醇体积分数的测定

采用重铬酸钾氧化分光度法测定咖啡果皮发酵液中乙醇的含量。取2 mL发酵液于离心管中，3 000 r/min离心2 min，取上清液1 mL于25 mL试管中，加5%K2Cr2O7溶液2 mL，沸水浴10 min显色，迅速冷却至室温，加无菌水定容至10 mL，混合均匀，在590 nm处测定吸光值。以无水乙醇为标准品制作标准曲线，从标准曲线求出测定样品中乙醇含量。试验得到标准曲线回归方程为y=5.5652x+0.0231（R2=0.9993）。

1.4.4 单因素试验

在无菌操作台内，咖啡果皮发酵培养基中接种10%白酒曲搅拌均匀，35℃、80 r/min下培养发酵，分别考察发酵时间为24 h、48 h、72 h、96 h、120 h时，对咖啡果皮发酵乙醇体积分数的影响；接种量为5%、8%、10%、12%、15%时，对咖啡果皮发酵乙醇体积分数的影响；氮源为硫酸铵、磷酸二氢铵、酵母浸粉、蛋白胨、尿素时，对咖啡果皮发酵乙醇体积分数的影响。

1.4.5 正交试验设计方案

在单因素试验的基础上，选取接种量、发酵时间、尿素3个因素，利用正交试验设计法对咖啡果皮发酵乙醇的工艺进行优化，试验因素及水平编码，见表1所示。

表1 正交试验因素级水平编码Tab.1 The factor level coding of orthogonal test

1.4.6 统计分析

采用SPSS17.0数据处理软件对实验数据进行统计分析，每组试验重复3次，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵时间对咖啡果皮发酵制备乙醇的影响

当发酵时间为24 h时，乙醇体积分数最大，为2.78%，故咖啡果皮发酵制备乙醇最佳时间为24 h。

2.1.2 接种量对咖啡果皮发酵制备乙醇的影响

接种量是发酵的基础，影响发酵效率和发酵效果。在发酵过程中，接种量的大小会影响酵母的生长，进而影响酒精发酵。图1表明，15%的接种量条件下，乙醇的体积分数最大，故最佳接种量为15%。

图1 接种量对乙醇体积分数的影响Fig.1 The effect of inoculation amount on ethanol volume fraction

2.1.3 不同氮源对咖啡果皮发酵制备乙醇的影响

见图2所示，尿素的乙醇体积分数显著高于其他氮源，故最佳氮源为尿素。

图2 不同氮源对乙醇体积分数的影响Fig.2 The effect of different nitrogen sourceson ethanol volume fraction

2.2 正交试验优化结果

根据单因素试验结果，选取接种量（A）、发酵时间（B）和尿素（C）3个因素，以乙醇体积分数为指标，采用L9（3）4正交表进行正交试验，结果见表2，各因素对乙醇体积分数影响的主次顺序为A＞B＞C。通过直接分析法，咖啡果皮发酵制备乙醇的最优工艺条件为A3B2C1；通过方差分析法，咖啡果皮发酵制备乙醇的最优工艺条件为A3B1C2，即接种量为25%、发酵时间为12 h、尿素为0.2%。

由于尿素对咖啡果皮发酵制备乙醇的影响最小，以尿素为误差所在列考虑接种量、发酵时间的显著性，可以看出接种量对咖啡果皮发酵制备乙醇的影响显著，方差分析，见表2所示。

表2 正交试验方差分析Tab.2 The variance of orthogonal test

2.3 验证试验

分别对直接分析法和方差分析法所得优化条件进行验证实验，方差分析法工艺条件（A3B1C2）下，乙醇体积分数为3.42%；直接分析法（A3B2C1）工艺条件下，乙醇体积分数为3.21%，故咖啡果皮发酵制备乙醇的最佳方案为A3B1C2。即接种量为25%、发酵时间为12 h、尿素为0.2%。

3 结语

文章以咖啡果皮为原料，通过对影响咖啡果皮发酵制备乙醇的3个因素（接种量、发酵时间、氮源）进行单因素试验，在此基础上进行正交试验，确定咖啡果皮发酵制备乙醇最优工艺条件为接种量为25%、发酵时间为12 h、尿素为0.2%，实际测定乙醇体积分数为3.42%。文章实验结果为生物质能源乙醇的大规模工业化生产提供相应的工艺参数和理论依据，同时也为咖啡加工后废弃物的综合利用和深入研究奠定了基础，避免了资源浪费。