白花丹醌调控TNF-α对肝癌细胞活性的影响*

张琼，刘培强，王娅囡，张奇志，贾艳敏，刘畅，弓韬

1.山东省立第三医院，山东 济南 250031； 2.山西医科大学第一医院，山西 太原 030001

在肿瘤疾病中，肝癌是死亡率相对较高的疾病，全球疾病死亡人数中约有43%的人为肝癌患者，对人们的生命安全造成了严重的威胁[1-3]。癌细胞的转移、侵袭过程十分复杂，与各种细胞因子、黏附相关分子、调节因子、信号转导通路等密切相关[4-6]。目前，肝癌治疗仍以手术切除最常见，虽然术后进行放疗、化疗等治疗，但复发和转移风险依旧存在[7]。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等炎性因子主要由T 细胞等免疫细胞产生，这些炎性因子参与肝癌细胞的增殖、转移过程，与肝癌的发生发展密切相关[8]。大量研究表明，TNF-α在细胞增殖、分化及凋亡方面发挥着重要作用，对转基因肝癌小鼠的TNF-α信号通路进行研究，发现其在肝癌组织中异常激活，并促进了肝癌细胞的增殖及转移[9]。白花丹属于蓝雪科植物中的一种常见中药，具有破瘀消积、行气止痛等功效。现代药理学研究表明，白花丹具有抗凝血、抗癌、抗氧化及保肝等作用[10]。研究发现，从白花丹中提取的白花丹醌在抗肿瘤方面具有显著作用，且不良反应少，明显提高了患者的生存质量[11]，但其具体作用机制的研究还处于起步阶段，白花丹醌能否通过阻断TNF-α信号的激活治疗肝癌还有待考察。由此，本文采用人肝癌细胞进行研究，探讨白花丹醌能否通过调控 TNF-α 水平对肝癌细胞活性和炎症因子产生影响。

1 材料

1.1 细胞系人肝癌细胞Hep G2(上海雅吉生物科技有限公司，货号：ZQ0022)，将细胞密封保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.2 药物与试剂白花丹醌(滁州仕诺达生物科技有限公司，货号：SND-1261，纯度：≥98%)。Trizol试剂(雷根生物科技有限公司，货号：NR0002)；SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒(江苏凯基生物科技发展有限公司，货号：KGP113)；逆转录试剂盒(上海研卉生物科技有限公司，货号：FSQ-301)；RT-PCR试剂盒(美国ABI公司，货号：7000)；胰蛋白酶(上海宝曼生物科技有限公司，货号：E0022)；MTT粉、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京伊塔生物科技有限公司，货号：YT1466、YT8173)；TNF-α及β-action的引物序列由赛默飞世尔科技有限公司合成；RPMI-1640培养基、TNF-α一抗、IL-1β一抗及IL-6二抗(武汉益普生物科技有限公司，货号：PM150110、ATA38860、ATA31401、FNab04283)；IL-6一抗(上海梵态生物科技有限公司，货号：FT-B8913S)；TNF-α及IL-1β二抗(上海恒斐生物科技有限公司，货号：bs-0078R-2、bs-0812R-2)；U6一抗[亚科因(武汉)生物技术有限公司，货号：ABP59155]；U6二抗[青木生物技术(武汉)有限公司，货号：ant-082]；DMEM培养基(上海麦克林生化科技有限公司，货号：D6515)；生理盐水(青岛尼赛欣和生物技术有限公司，货号：30105)；二甲基亚砜(上海吉至生化科技有限公司，货号：D54260)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，北京伊塔生物科技有限公司，货号：YT0230-2)；PBS溶液(上海广锐生物科技有限公司，货号：PR694)；乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA，北京伊塔生物科技有限公司，货号：YT0912)；Annexin V FITC(上海经科化学科技有限公司，货号：AD10)；PI、RIPA裂解液(北京伊塔生物科技有限公司，货号：YT1784、SY4680)；ECL荧光试剂盒(江苏凯基生物科技发展有限公司，货号：KGP1123)。

1.3 仪器7500型实时荧光定量PCR仪(美国 Invitrogen 公司)；5024R型高速冷冻离心机(离心半径：8.5 cm，德国Eppendorf公司)；Analyzer 16 型流式细胞仪(德国美天旎生物技术有限公司)；CX43型显微镜[奥林巴斯(北京)销售服务有限公司]。

2 方法

2.1 细胞培养与分组取HepG2细胞悬浮液，在37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养，待细胞完全贴壁后，弃掉培养液，加入0.25%的胰蛋白酶，用吸管吹打制成细胞悬浮液后转移到新培养基中进行传代培养，待培养至第5代时收集细胞，调整细胞浓度至1×105mL-1。取1 mL细胞悬液接种于16孔板中，并分为Nc组、Bd组、Bz组及Bg组，Nc组采用细胞培养基培养，Bd组、Bz组及Bg组细胞培养基中分别加入5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1的白花丹醌培养，48 h后，弃去上层清液，加入DMEM培养基，培养48 h收集细胞备用。

2.2 MTT检测HepG2细胞的增殖能力将上述收集的HepG2细胞密度调整至5×104mL-1，取 200 μL 细胞悬液接种于96孔板，在37 ℃、5%CO2的条件下培养48h后加入50 μL MTT，37 ℃下培育4 h，去上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶液，12 h后使用酶标仪在490 nm波长处检测HepG2细胞OD值。

2.3 Transwell实验检测HepG2细胞的迁移能力各组细胞采用无血清培养液进行饥饿处理18 h[12]，加入100 μL 0.25%胰蛋白酶进行溶解消化后，2 000 r·min-1离心5 min，去上清液用含BSA的培养基将细胞密度调整至5×105mL-1，在Transwell小室上层中加入200 μL细胞悬液，将其放入培养基中培养18 h后，弃掉培养液，用PBS洗涤2次，无水甲醛固定20 min后将小室适当风干，用结晶紫溶液进行染色，20 min后用棉签轻试掉上层未迁移细胞，用PBS洗涤3次后，用显微镜任意选取5个视野细胞进行观察。

2.4 流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡率各组细胞用PBS洗涤3次，加入100 μL不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞30 s，摇匀悬浮液后转移至5 mL流式试管中，2 000 r·min-1离心5 min，去上清液后PBS洗涤3次，重悬细胞，加入5 μL Annexin V FITC及5 μL PI，摇匀染色，室温避光孵育15 min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.5 Western blot检测HepG2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的表达水平取细胞悬浮液置于离心管中，加入0.25%胰蛋白酶后，放入冰箱中冷冻10 min使其完全裂变后，洗涤细胞3次，加入1 mL RIPA裂解液并充分搅拌，4 ℃、10 000 r·min-1离心10 min后，取上清液，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒对各组细胞中蛋白进行定量分析，将各组蛋白调至等浓度后，用SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒进行电泳，半干法转移至甲醇活化的PVDF膜上，在120V条件下转膜1.5 h后，37 ℃、5%的BSA条件下封闭2 h。加入TNF-α、IL-1β、IL-6一抗(11 000)，4 ℃摇床振荡孵育过夜后洗膜，加入稀释的二抗(15 000)，37 ℃室温孵育2 h。洗膜后，用ECL荧光试剂盒曝光、显影，凝胶成像系统扫描各蛋白条带的灰度值，以U6为内参蛋白，计算TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达量。

2.6 RT-PCR检测HepG2细胞TNF-αmRNA的水平严格按照试剂盒说明书进行，取HepG2细胞悬浮液加入Trizol试剂提取总RNA，采用逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA，利用实时荧光定量PCR仪，在95 ℃条件下预变性10 min，变性30 s，在72 ℃条件下延伸1 min，59 ℃条件下退火30 s，此循环进行40次，收集荧光信号，内参采用β-action，实验结束后，用2-ΔΔCT计算TNF-α的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

3 结果

3.1 白花丹醌对HepG2细胞增殖能力的影响采用MTT法检测白花丹醌对Hep G2细胞增殖能力的影响。与Nc组相比，不同浓度的白花丹醌均能显著抑制Hep G2细胞的增殖(P<0.05)，其中Bg组效果最为显著。见图1。

图1 白花丹醌对HepG2细胞增殖能力的影响

3.2 白花丹醌对HepG2细胞迁移能力的影响采用Transwell实验检测白花丹醌对Hep G2细胞迁移能力的影响。与Nc组相比，不同浓度的白花丹醌均能显著抑制Hep G2细胞的迁移能力(P<0.05)，其中Bg组效果最为显著。见图2。

图2 白花丹醌对HepG2细胞迁移能力的影响(×100)

3.3 白花丹醌对HepG2细胞凋亡的影响采用流式细胞术检测白花丹醌对Hep G2细胞凋亡的影响。与Nc组相比，不同浓度的白花丹醌均能显著促进Hep G2细胞凋亡(P<0.05)，其中Bg组效果最为显著。见图3，图4。

图3 白花丹醌对HepG2细胞凋亡的影响

3.4 白花丹醌对Hep G2细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达的影响采用Western blot检测白花丹醌对Hep G2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达的影响。与Nc组相比，不同浓度的白花丹醌均能显著降低Hep G2细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 蛋白的表达水平(P<0.05)，其中Bg组效果最为显著。见图5，图6。

注：与Nc组相比，aP<0.05；与Bd组相比，bP<0.05；与Bz相比，cP<0.05图4 白花丹醌对HepG2细胞凋亡的影响

图5 白花丹醌对Hep G2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达的影响

注：与Nc组相比，aP<0.05；与Bd组相比，bP<0.05；与Bz相比，cP<0.05图6 白花丹醌对Hep G2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达的影响

3.5 白花丹醌对Hep G2细胞中TNF-αmRNA水平的影响采用RT-PCR检测白花丹醌对Hep G2细胞TNF-αmRNA水平的影响。与Nc组相比，不同浓度的白花丹醌均能显著降低Hep G2细胞中TNF-αmRNA的表达水平(P<0.05)，其中Bg组效果最为显著。见图7。

注：与Nc组相比，aP<0.05；与Bd组相比，bP<0.05；与Bz相比，cP<0.05图7 白花丹醌对Hep G2细胞TNF-α mRNA水平的影响

4 讨论

肝癌属于消化道恶性肿瘤，是一种发病率位居全球恶性肿瘤前十的疾病，每年死亡人数超过100万人，中国肝癌患病率占全球4成以上，且病死率将近50%[13]。白花丹醌是集抗转移、不易耐药、无不良反应等多种优点于一身的抗癌成分，广泛应用于临床且疗效显著[14]。研究发现，TNF-α作为炎性因子参与多种肿瘤疾病的发生发展，而肝癌的发生与TNF-α激活有极大关系，TNF-α通过与关联受体互相作用，与目的基因在细胞核中结合来参与肝癌进程[15]。随着对TNF-α的深入研究，发现TNF-α在肝癌增殖、转移过程中扮演重要角色[16]。

本研究发现，白花丹醌能显著抑制Hep G2细胞的增殖、迁移能力，促进Hep G2细胞凋亡，且呈浓度依赖趋势。在中医中，肝癌属于“肝积”“黄疸”等范畴，多属“肝郁脾虚”证，因此中医对肝癌的治疗，多侧重于活血化瘀、散结止痛[17]。白花丹是一种常见能消肿、祛风、解毒的中药，其提取物白花丹醌属于萜烯类化合物，可以通过阻碍癌细胞周期来到达抗癌的目的。其次，白花丹醌可以提升肿瘤的免疫原性，对荷瘤机体中免疫细胞功能恢复具有显著促进作用，且其具有毒副作用小、不易耐药性等优点[18]。对于肝癌细胞，白花丹醌主要是通过调节VEGF等基因启动因子，负向调控细胞周期，来抑制多种信号通路的激活，抑制肿瘤新生血管生成，从而促进细胞凋亡，抑制细胞增殖及迁移。研究表明，白花丹醌在体外显著抑制肝癌细胞增殖，可以使癌细胞生长周期受到阻滞并停留在G1 期，从而达到抑制肿瘤生长的目的[19-20]。

本研究发现，白花丹醌能显著降低Hep G2细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的表达水平及TNF-αmRNA的表达水平，且呈浓度依赖趋势。报道显示，TNF-α蛋白活性降低可抑制肿瘤癌基因的表达，从而发挥“抑癌基因”的作用[21-22]。研究表明，在癌症患者机体中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子表达多数都呈上升趋势，从而导致机体免疫损伤加剧，如抑制胶质瘤中的TNF-α蛋白表达，其癌细胞放射敏感性就会随之升高，这使得放、化疗的效果得到了显著的提高[23]。TNF-α通路与众多肿瘤都有着密切联系，在胃癌、乳腺癌中 TNF-α 表达变化对患者的预后有重要的指导价值，当TNF-α信号被激活时，可加快癌细胞分化，最终导致肿瘤的形成[24-26]，这与本文研究相符。刘雪梅等[27]通过体外实验研究发现，给予白花丹醌干预的人肝星状细胞中TNF-αmRNA和PDGF-BB水平明显降低，提示白花丹醌可通过抑制炎性因子表达发挥抗纤维化作用。张吉仲等[28]建立移植性肝癌小鼠模型，给予白花丹醌干预，发现白花丹醌干预后大鼠体内血清中IL-2、TNF-α水平降低，且肿瘤生长抑制率明显升高，说明白花丹醌可能是通过抑制炎性因子的表达来抑制肿瘤生长。

综上所述，白花丹醌可通过调控TNF-α的活性，降低炎症因子的表达，抑制肝癌细胞增殖和迁移能力。