石菖蒲通过CXCR4-PI3K信号通路对脑出血大鼠小胶质细胞自噬的影响*

李芝明，付胜奇，刘变化，刘欣

1.郑州人民医院，河南 郑州 450053； 2.郑州大学附属郑州中心医院，河南 郑州 450007

脑出血是脑卒中的一种，世界范围内每年发病人数约为200万，致死率、致残率极高，严重影响患者的生命健康及生存质量[1]。目前关于脑出血的治疗以服用降颅压、降血压、控制脑水肿等药物为主，但缺乏针对性治疗手段，多数患者仍存在神经功能缺损[2-3]。研究发现，脑出血发生后，神经元细胞继发性持续死亡是导致神经功能缺损的重要因素，而小胶质细胞自噬是神经元细胞继发性持续死亡的主要形式，同时也是影响神经功能恢复的重要因素[4]。因此，寻找有效抑制小胶质细胞自噬的药物对临床治疗脑出血有重要意义。近年来，中医药在治疗脑出血疾病中发挥重要作用。中医认为脑出血的病因为瘀热阻窍，故治疗以活血散热、散瘀止痛为主[5-7]。石菖蒲为天南星科植物，具有醒神益智、降火清痰、保护心肌细胞的功效。研究证实，石菖蒲有减轻脑出血后细胞肿胀，减轻脑水肿，保护脑组织的作用[8]，但关于石菖蒲脑保护的作用机制仍需要进一步探讨。研究表明，趋化因子受体4(chemokine receptor 4，CXCR4)-磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信号通路在小胶质细胞自噬过程中起重要调控作用[9]。因此，本研究建立脑出血大鼠模型，观察石菖蒲通过CXCR4-PI3K信号通路对模型大鼠小胶质细胞自噬的影响及神经保护作用，为临床治疗脑出血疾病提供参考。

1 材料

1.1 动物健康雄性SD大鼠，8周龄，50只，体质量250～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SYXK(京)2018-0086。

1.2 药物与试剂石菖蒲萃取物(长沙华康生物技术开发有限公司，粉末状，批号：180507)。水合氯醛(广州市虎傲化工有限公司，货号：302-17-0)；多聚甲醛、氨水、二甲苯、乙醇、戊二醛、柠檬酸铅(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：C104190、A299541、X139941、E111994、G105907、L303843)；苏木精染液、伊红染液(德州润昕实验仪器有限公司，批号：180201、180604)；磷酸缓冲液(美国Sigma公司，货号：P5368-10PAK)；醋酸双氧铀(海德创业生物科技有限公司，货号：HD28000)；10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1链霉素(美国Hyclone公司，货号：SH30088.02、SV30010、SV30079.01)；总RNA提取试剂盒(Trizol法)(美国Invitrogen公司，货号：15596-018)；SYBR Premix Ex Taq试剂盒(日本TAKARA公司，货号：DRR041A)；Taq Man反转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，货号：QN0943)；盐酸乙醇、RIPA裂解液(碧云天生物科技有限公司，货号：C0165S、P0013C)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，美国Biovision公司，货号：2119-10)；10×TBST缓冲液(北京索莱宝科技有限公司，货号：T1081)；BCA蛋白定量检测试剂盒(武汉默沙克生物科技有限公司，货号：69-97682)；兔抗大鼠CXCR4、PI3K、AKT、Beclin-1、GAPDH一抗及山羊抗兔IgG(二抗)(美国Abcam公司，货号：ab124824、ab154598、ab38449、ab207612、ab181602、ab6721)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 仪器脑立体定位仪(美国Stoelting公司)；E-Gel Imager凝胶成像仪(北京普瑞麦迪实验室技术有限公司)；ABI 7900型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；DYY-4C型电泳仪(上海巴玖实业有限公司)；ZPS0850型光学显微镜(苏州瑞文光电科技有限公司)；CX23型电子显微镜(日本Olympus Corporation公司)。

2 方法

2.1 造模分组及药物干预50只SD大鼠随机取10作为假手术组，剩余40只采用Rosenberg法[10]建立脑出血大鼠模型，以350 mg·kg-1的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，头部固定于脑立体定位仪上，取正中部位，头皮消毒，切口，用手术刀剥离骨膜，使其冠状缝和前卤裸露。前囟前2.0 mm，中线右侧 3.0 mm 处钻直径为1.0 mm的圆孔，用微量注射器从股动脉抽取50 μL血液，以2 μL·min-1的速度将血液注射到圆孔内，留针5 min后出针，缝合伤口，消毒防止感染。以模型大鼠清醒后出现同侧Horner征为造模成功标准，即没有方向性的自主活动、提尾时自行向右转圈、右前肢瘫痪或内收、曲头朝向右侧背部。36只大鼠造模成功，随机分为模型组及石菖蒲低、中、高剂量组，每组9只。石菖蒲低、中、高剂量组以10 mL·kg-1体积腹腔注射 0.05 g·mL-1、0.1 g·mL-1、0.2 g·mL-1石菖蒲溶剂，假手术组和模型组腹腔注射等量生理盐水，每天1次，连续给药7 d。

2.2 神经功能评估给药干预7 d后，采用Garcia法[11]对各组大鼠进行神经功能评分，共6项测试：自主运动0～3分；活动对称性0～3分；触摸反应1～3分；金属丝鼠笼攀援1～3分；前肢对称性0～3分；触摸双侧躯干反应1～3分，各项得分总和为神经功能评分，分数越低代表神经功能缺损越严重。

2.3 组织取材神经功能评分完成后处死大鼠，立即取出伤灶侧大脑皮质。每组4只大鼠的大脑皮质放4%多聚甲醛中固定，剩余5只大鼠的大脑皮质放于-80 ℃保存，备用。

2.4 大脑皮质病理学观察取出固定的大脑皮质，石蜡包埋，冠状切片厚度4 μm，脱蜡，自来水冲洗，苏木精染液染色2 min，自来水冲洗，0.5 %盐酸乙醇液分化2 s，自来水冲洗，1%氨水返蓝5 s，自来水冲洗，伊红染液浸染1 min，自来水冲洗后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干，光学显微镜下观察，每张切片随机选5个不同视野拍照。

2.5 大脑皮质小胶质细胞自噬的超微结构观察取-80 ℃保存的大脑皮质，放4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中，4 ℃固定24 h，0.1 mol·L-1磷酸缓冲液漂洗，3%戊二醛固定2 h，环氧树脂包埋，冠状切片，厚度约0.12 μm，用1 %醋酸双氧铀、0.2%柠檬酸铅染色，电子显微镜下观察小胶质细胞的超微结构。

2.6CXCR4、PI3K、AKT、Beclin-1mRNA相对表达量检测取-80 ℃保存的大脑皮质，采用Trizol法总蛋白提取试剂盒提取总RNA，Taq Man反转录试剂盒获取cDNA模版，参照SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书要求进行RT-qPCR扩增。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，57 ℃退火 35 s，72 ℃延伸1 min，设40次循环。以GAPDH为内参，2-△△CT法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

2.7 CXCR4、PI3K、AKT、Beclin-1蛋白相对表达量检测取-80 ℃保存的大脑皮质，加入1 mmol·L-1RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min，离心半径10 cm，取上清，置沸水浴 10 min，再次离心取上清，BCA法进行蛋白定量，之后将蛋白放置于装有沸水的烧杯中10 min，使其变性，蛋白变性后置冰上冷却10 min。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，每孔上样20 μL，100 V 电压进行电泳、转膜。转膜完成后，将膜放5% BSA中封闭1 h，加入一抗(11 000)，4 ℃过夜，TBST清洗3次，加二抗(13 000)，室温孵育 1 h，TBST清洗3次，将膜放入凝胶成像系统中扫描，Image 软件分析目的条带灰度值，目的条带与内参条带GAPDH灰度值的比值表示蛋白表达水平。

3 结果

3.1 石菖蒲对脑出血大鼠神经功能评分的影响与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著降低(P<0.001)；与模型组比较，石菖蒲低、中、高剂量组大鼠神经功能评分显著升高(P<0.05)，其中石菖蒲高剂量组神经功能评分显著高于中、低剂量组(P<0.01)，中剂量组神经功能评分显著高于低剂量组(P<0.05)。提示石菖蒲能改善脑出血大鼠的神经功能。见表2。

表2 石菖蒲对脑出血大鼠神经功能评分的影响 分)

3.2 石菖蒲对脑出血大鼠脑组织病理学的影响假手术组大脑皮质细胞排列规则，胞核形状均匀，细胞间隙正常；模型组脑组织病理损伤严重，细胞排列散乱，胞核固缩，细胞间隙增大；石菖蒲低、中、高剂量组脑组织病理损伤程度、细胞排列散乱程度均减轻，其中石菖蒲高剂量组减轻最明显。提示石菖蒲能改善脑出血大鼠的脑组织病理状态。见图1。

注：A：假手术组；B：模型组；C：石菖蒲低剂量组；D：石菖蒲中剂量组；E：石菖蒲高剂量组图1 石菖蒲对脑出血大鼠脑组织病理学的影响(HE染色，×400)

3.3 石菖蒲对脑出血大鼠大脑皮质小胶质细胞自噬超微结构的影响假手术组未见明显自噬细胞；模型组出现大量双模结构的自噬细胞，含有多种被分解的残余细胞器；石菖蒲低、中、高剂量组自噬细胞数量减少，其中石菖蒲高剂量组最少，但仍存在少量自噬细胞。提示石菖蒲能降低脑出血大鼠大脑皮质小胶质细胞的自噬。见图2。

注：A：假手术组；B：模型组；C：石菖蒲低剂量组；D：石菖蒲中剂量组；E：石菖蒲高剂量组；红色箭头表示自噬细胞图2 石菖蒲对脑出血大鼠大脑皮质小胶质细胞自噬超微结构的影响(×10 000)

3.4 石菖蒲对脑出血大鼠大脑皮质CXCR4-PI3K信号转导通路相关基因相对表达量的影响与假手术组比较，模型组CXCR4、Beclin-1mRNA相对表达量显著升高(P<0.001)；与模型组比较，石菖蒲低、中、高剂量组CXCR4、Beclin-1mRNA水平显著降低(P<0.05)，其中石菖蒲各剂量组间CXCR4、Beclin-1mRNA的水平均有显著性差异(P<0.05)。提示石菖蒲能显著抑制脑出血大鼠大脑皮质CXCR4-PI3K信号转导通路的激活。见表3。

表3 石菖蒲对脑出血大鼠大脑皮质CXCR4-PI3K信号转导通路相关基因相对表达量的影响

3.5 石菖蒲对脑出血大鼠大脑皮质CXCR4-PI3K信号转导通路相关蛋白相对表达量的影响与假手术组比较，模型组CXCR4、Beclin-1蛋白表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的水平显著升高(P<0.001)；与模型组比较，石菖蒲低、中、高剂量组CXCR4、Beclin-1蛋白表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平显著降低(P<0.05)，且石菖蒲各剂量组间蛋白表达水平有显著性差异(P<0.05)。提示石菖蒲能显著抑制脑出血大鼠大脑皮质CXCR4-PI3K信号转导通路的激活。见表4，图3。

表4 石菖蒲对脑出血大鼠大脑皮质CXCR4-PI3K信号转导通路相关蛋白相对表达量的影响

注：A：假手术组；B：模型组；C：石菖蒲低剂量组；D：石菖蒲中剂量组；E：石菖蒲高剂量组图3 石菖蒲对脑出血大鼠大脑皮质CXCR4-PI3K信号转导通路相关蛋白相对表达量的影响

4 讨论

脑出血是由非外伤性脑内血管破裂引起的，是脑血管疾病中致死率最高的疾病之一，脑出血患者3个月内的病死率达20%[12]。脑出血后血肿部位周围发生继发性脑损伤，产生神经元坏死，引发神经功能障碍[13-14]。目前对脑出血的主要治疗手段有颅内压治疗及血压控制，但上述手段不能尽快控制脑出血产生的继发性损伤。越来越多的研究证实，细胞自噬与肿瘤的发生发展密切相关，过度自噬会导致细胞死亡，是许多脑损伤疾病产生的机制之一[15-17]。因此，寻找有效的治疗药物抑制细胞自噬，对治疗脑出血疾病有重要意义。

石菖蒲是多年生草本植物，具有开窍、宁心安神、祛湿等功效。现代药理研究表明，石菖蒲具有保护神经元、调节中枢神经系统的作用[18-19]。ZHANG等[20]研究发现，石菖蒲能有效改善帕金森鼠的行为学能力。石菖蒲是破血逐瘀方中的主要中药材，钟建斌等[21]研究发现，破血逐瘀方联合依达拉奉能降低脑出血血肿周围组织水肿，改善脑出血患者的神经功能。陈璐等[22]研究发现，石菖蒲挥发油能抑制神经胶质瘤细胞自噬，进而保护大脑的神经功能。本研究发现，石菖蒲组大鼠的神经功能评分显著高于模型组，脑组织损伤程度、细胞排列散乱程度以及细胞自噬程度均较模型组有所减轻，说明石菖蒲能有效改善脑出血大鼠的神经功能。

CXCR4是趋化因子基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)的特异性受体，SDF-1与CXCR4结合形成SDF-1/CXCR4信号轴，在脑出血导致的神经功能受损中发挥重要作用[23]。研究发现，诱导自噬蛋白Beclin-1参与脑出血引发的细胞内环境变化，对轻、中度脑出血有保护作用，但过度自噬会导致细胞死亡，是许多脑损伤疾病产生的机制之一[24]。PI3K磷酸化影响细胞自噬活动，SDF-1/CXCR4信号轴与PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信号通路结合，可形成复杂的CXCR4-PI3K信号通路，在调控细胞自噬、修复神经和保护大脑等方面发挥关键作用[25-27]。HUANG等[28]研究发现，CXCR4抑制剂可以抑制小胶质细胞的迁移，改善脑出血大鼠的神经功能。仇至富等[29]研究发现，补阳还五汤能激活脑出血大鼠脑组织中CXCR4-PI3K信号转导通路，抑制细胞自噬，进而调控细胞稳态，调节大鼠的神经功能。以上研究表明，CXCR4-PI3K信号通路参与调控细胞自噬并影响神经功能。本研究发现，石菖蒲可显著降低CXCR4、Beclin-1mRNA及蛋白相对表达量及 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平，说明石菖蒲能通过CXCR4-PI3K信号转导通路抑制细胞自噬，对脑出血引起的神经功能紊乱起保护作用。

综上所述，石菖蒲能降低脑出血大鼠小胶质细胞自噬，改善大脑神经功能，可能是通过CXCR4-PI3K信号转导通路发挥作用，为脑出血相关药物研发及临床治疗提供参考。