T淋巴细胞耗竭在耐多药肺结核患者免疫表达中的初步研究

王丽 熊坤龙 朱长太 范琳

耐多药肺结核(multidrug-resistant pulmonary tuberculosis，MDR-PTB)因治愈率低、费用高、不良反应大等问题，迫切需要新的提高其治愈率的治疗方法[1-2]。机体感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)后，经过抗原呈递细胞(antigen-presenting cells, APC)的成熟、活化及提呈，负载抗原的APC被迁移至局部淋巴组织并提呈给T淋巴细胞，经抗原识别、活化、增殖、分化后迅速做出相应的免疫应答反应[3]，但当T淋巴细胞持续接触大量抗原后，就会出现损伤，甚至耗竭[4]。由于目前对MTB持续刺激引起肺结核患者T淋巴细胞耗竭的研究多是针对普通肺结核，即便有MDR-PTB对MTB抗原的整体免疫应答降低和免疫功能受损的研究[5-8]，也并未探讨其降低原因，更少见对T淋巴细胞耗竭的报道。因此，笔者纳入药物敏感性肺结核(drug susceptible pulmonary tuberculosis，DS-PTB)和MDR-PTB两种类型患者，探讨MDR-PTB患者是否存在T淋巴细胞耗竭，以及这种耗竭状态下机体免疫功能发生了何种变化。

对象和方法

一、研究对象遴选

1.研究对象：采用前瞻性研究的方法，选取2020年1—8月同济大学附属上海市肺科医院住院治疗的58例肺结核患者作为研究对象，其中，MDR-PTB患者20例(MDR-PTB组)，DS-PTB患者38例(DS-PTB组)。MDR-PTB组男性和女性分别为13例(65.0%)和7例(35.0%)，年龄范围[中位数(四分位数)]为17～58岁[33.0(29.5,40.5)岁]，并发慢性阻塞性肺疾病和支气管扩张症1例(5.0%)；DS-PTB 组男性和女性分别为27例(71.1%)和11例(28.9%)，年龄范围[中位数(四分位数)]为15～65岁[30.0(24.0,46.0)岁]，并发慢性阻塞性肺疾病和支气管扩张症1例(2.6%)；两组上述指标比较，差异均无统计学意义(χ2=0.224，P=0.636；Z=0.855，P=0.398；χ2=0.221，P=0.638)。同期纳入健康志愿者(HD组)20名，其中，男性16名，女性4名，年龄范围[中位数(四分位数)]为20～42岁[29.5(26.8，32.5)岁]，无任何慢性疾病、感染及其他疾病。本研究已通过同济大学附属上海市肺科医院伦理委员会批准(编号：K20-024Y)。

2.病例组入组标准：病例组患者均为痰分枝杆菌培养阳性且菌种鉴定为MTB，体外药物敏感性试验(简称“药敏试验”)提示为耐多药或对一线及二线抗结核药物均敏感，未接受抗结核药物治疗者。且排除非结核分枝杆菌感染、并发免疫缺陷疾病、长期服用免疫抑制剂者，或并发恶性肿瘤、糖尿病、结核性胸膜炎、其他肺外结核或重度营养不良者。

二、主要仪器及试剂

选用同济大学附属上海市肺科医院国家结核病重点实验室制备的MTB标准株H37Rv为参照菌株。主要使用仪器及试剂为DxFLEX流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司)；TECAN Infinite 200 PRO酶标仪[帝肯(上海)贸易有限公司]；Sorvall ST 16R离心机(美国赛默飞世尔科技公司)；RPMI1640培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素(美国Gibco公司)；人外周血淋巴细胞分离液(美国GE公司)；红细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；抗人CD4-FITC(555346)、抗人CD3-PerCP-Cy5.5(552852)、抗人CD8-AF700(5579450)、 抗人Tim-3-BV650(565565)、抗人IFN-γ-PE-Cy7(557844)、抗人TNF-α-APC(554514)、抗人IL-2-BV421(564164)单克隆荧光抗体，以及固定活性染料510(564406)、胞内蛋白转运抑制剂[布雷非德素A(555029)]和杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco’s phosphate buffered saline，D-PBS)均购自美国BD公司；同型对照IgG1抗体(562652)、抗人PD-1-BV605(329924)单克隆荧光抗体均购自美国BioLegend公司；抗人Lag-3-APC-eF780单克隆荧光抗体(47-2239-42)购自美国赛默飞世尔科技公司。

三、研究方法

分离三组研究对象外周血单个核细胞(periphe-ral blood mononuclear，PBMC)，利用流式细胞术检测其MTB抗原特异性CD4+和CD8+T淋巴细胞表面程序性死亡受体-1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)和淋巴细胞活化基因-3(Lag-3)等抑制性受体的表达水平，以及胞内细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌水平。

1.PBMC的分离：分别采集三组研究对象肘部静脉血各10 ml，并进行抗凝处理。利用磷酸盐缓冲液(PBS)等量稀释，混匀，将稀释后的血液加至淋巴细胞分离液上层。室温1360×g离心20 min，用毛细滴管吸取中间外周血淋巴细胞层置于新的15 ml离心管中，再室温470×g离心6 min，洗涤细胞。弃上清，加入4 ml 红细胞裂解液，室温放置10 min，去除红细胞。350×g离心6 min，洗涤2次。收集管底细胞并计数，使用RPMI 1640完全培养基调整细胞浓度为4×106/ml，进行表面和细胞内染色。

2.流式细胞术检测：加入500 μl/孔单细胞悬液于24孔微孔板中。MTB刺激组另需加入H37Rv(10 μg/ml)，37 ℃培养72 h。染色前4 h，加入布雷非德菌素A(4 μl/ml)，混匀，在37 ℃培养5 h后收取细胞，4 ℃ 350×g离心洗涤5 min，弃上清，使用1 ml D-PBS重悬。加入1 μl 固定活性染料510染色10 min，4 ℃ 350×g离心洗涤 5 min。加入抗人CD4-FITC、抗人CD3-PerCP-Cy5.5、抗人CD8-AF700、抗人Lag-3-APC-eF780、抗人PD-1-BV605、抗人Tim-3-BV650等单克隆荧光抗体各2 μl(200 μl/管)，避光4 ℃孵育30 min， 4 ℃ 350×g离心洗涤5 min，弃上清。加入250 μl固定破膜液重悬细胞，避光4 ℃ 孵育20 min，离心洗涤。加入抗人IL-2-BV421、抗人IFN-γ-PE-Cy7、抗人TNF-α-APC各2 μl，避光4 ℃孵育30 min后350×g离心洗涤5 min，使用200 μl D-PBS重悬，上机检测。

四、统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行数据的统计分析。偏态分布的计量资料采用“中位数(四分位数)[M(Q1,Q3)]”表示，组间差异的比较采用Mann-WhitneyU检验(独立样本)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、T淋巴细胞表面抑制性受体的表达水平

MDR-PTB组CD4+和CD8+T淋巴细胞表面PD-1和Tim-3的表达水平均明显高于DS-PTB组和HD组，但DS-PTB组与HD组间差异均无统计学意义。CD4+和CD8+T淋巴细胞表面的Lag-3表达水平在三组间两两比较的差异均无统计学意义，见表1。

表1 CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞表面抑制性受体在三组研究对象中表达情况的比较 [%，M(Q1,Q3)]

二、T淋巴细胞分泌免疫效应因子情况

MDR-PTB组和DS-PTB组CD4+和CD8+T淋巴细胞内IL-2分泌水平均明显高于HD组(P值均<0.01)；而MDR-PTB组与DS-PTB组间差异均无统计学意义。DS-PTB组CD4+T淋巴细胞内IFN-γ分泌水平明显高于HD组(P<0.05)；DS-PTB 组和MDR-PTB组CD8+T淋巴细胞内IFN-γ表达水平均明显高于HD组(P值均<0.05)，而DS-PTB组与MDR-PTB组比较差异均无统计学意义。DS-PTB组CD4+T淋巴细胞内TNF-α分泌水平均明显高于MDR-PTB组和HD组(P值均<0.01)，而CD8+T淋巴细胞内TNF-α的分泌水平在三组间两两比较的差异均无统计学意义，见表2。

表2 CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞内免疫效应因子在三组研究对象中表达情况的比较 [%，M(Q1,Q3)]

讨 论

MDR-PTB发病率的持续攀升进一步加重了结核病经济负担。探讨T淋巴细胞耗竭对MDR-PTB的免疫效应表达的影响，为治疗MDR-PTB寻找新策略、提高治愈率提供了依据。T淋巴细胞耗竭是宿主发生慢性感染及恶性肿瘤的免疫特征之一[9-10]。在MTB感染菌量较大且时间较长时，会出现CD4+和CD8+T淋巴细胞耗竭，使机体处于免疫抑制状态，不能有效清除MTB，表现为抑制性抗体如PD-1、Tim-3和Lag-3表达水平的升高[11-13]，这些指标的变化在慢性疾病中可作为T淋巴细胞耗竭的标记。PD-1、Tim-3和Lag-3是细胞表面上的一类抑制性分子，当人体免疫系统被激活时，这些免疫检查点分子介导的抑制性通路就会被启动，通过调控免疫反应的强度或持续时间来抑制免疫应答，降低其对周围组织的损伤[14]。PD-1持续表达是T淋巴细胞耗竭的表现特征之一[15]；而Tim-3可抑制T淋巴细胞的活化，促使其失活，并且下调效应细胞因子的产生[16]；Lag-3则通过与其配体结合，抑制辅助性Th1细胞的活化[17]，故抑制三者的表达水平可促进T淋巴细胞的增殖[18]。

本研究通过比较MDR-PTB、DS-PTB和HD组抑制性受体表达量的变化，来观察MDR-PTB与DS-PTB细胞受损状态的不同，从而判断MDR-PTB是否发生T淋巴细胞耗竭现象。结果发现，MDR-PTB患者的CD4-/CD8-PD-1和Tim-3的表达量明显高于HD组和DS-PTB组，而DS-PTB组数值虽稍高于HD组，但差异无统计学意义。这提示DS-PTB组T淋巴细胞较HD组已开始出现受损状态，而MDR-PTB患者已发生T淋巴细胞耗竭，且PD-1和Tim-3处于耗竭高峰状态。但Lag-3在MDR-PTB患者中的表达量升高与其他两组的差异均不明显，这可能与本研究纳入患者例数有限，结果不足以真实反映Lag-3的表达变化有关。

另一方面，IL-2、IFN-γ和TNF-α多由活化的T淋巴细胞分泌，在宿主对抗MTB感染的过程中起着重要作用[19-20]，常被作为分析T淋巴细胞功能的指标。研究发现，MDR-PTB患者外周血中的Th1和Th2细胞亚群比例失衡，可出现明显抑制免疫反应和下调IFN-γ和IL-2等细胞因子分泌水平的情况[19]。另有研究认为，当IFN-γ基因缺失时也会降低宿主对MTB的抵抗能力[21]，如CD4-IFN-γ分泌能力在严重空洞性肺结核患者中呈下降趋势[22]，且慢性难治性结核病患者的TNF-α也明显低于新发患者，这些均提示IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌水平均与肺结核病情密切相关[23]。本研究证实并扩展了上述对于MDR-PTB患者体外低反应性的观察。与健康组(HD组)相比，DS-PTB组患者的CD4+、CD8+T淋巴细胞释放的IL-2、IFN-γ、TNF-α明显增多，说明DS-PTB虽免疫受损，但仍可以对MTB感染作出快速反应，促炎症因子迅速升高，可能与Th1对MTB发生一定程度的免疫抵抗有关。另一方面，MDR-PTB患者的T淋巴细胞释放的CD4-TNF-α明显低于DS-PTB患者，说明MDR-PTB患者T淋巴细胞已发生了耗竭，其抑制性受体的高表达已受到耗竭的影响；同时，CD4-IL-2和CD4-/CD8-IFN-γ的分泌水平也呈现下降趋势，但差异均无统计学意义，这可能与不同细胞因子对MTB抗原特异性免疫应答的差异性有关。另外，本研究选取的肺结核患者在采血前均未开始有效的抗结核药物治疗，且已剔除了相关并发症(肿瘤、糖尿病、支气管结核、结核性胸膜炎等)、贫血以及营养不良患者，可认为表达情况的差异主要来源于患者对药物的耐药程度。

综上，MDR-PTB患者可因持续MTB感染而出现T淋巴细胞耗竭，不能有效控制MTB感染进程，从而使得疾病迁延不愈。