种稻年限对盐渍化土壤理化性质和细菌群落多样性的影响

李 明，马 飞，张俊华

(1.宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021；2. 宁夏大学葡萄与葡萄酒研究院，宁夏 银川 750021；3. 宁夏大学环境工程研究院，宁夏 银川 750021)

宁夏银北地区为典型的干旱、半干旱地区，该区域降雨稀少，蒸发强烈，地下水位高，在强烈的蒸发作用下，盐分不断累积于土壤表层，土壤发生不同程度的盐渍化[1]。土壤盐渍化影响了作物生长，严重制约了该地区农业生产的发展。银北地区现有盐碱土面积约1.0×105hm2，占宁夏盐碱地总面积的58%以上[2]，盐碱化土壤主要以平罗县西大滩一带为典型代表[3]。作为宁夏主要商品粮生产基地之一[4]，由于该地区土地平整，水资源便利，适合大面积种植水稻。

基于水稻种植在粮食生产及全球气候变化中的重要地位，稻田耕作年限对土壤生态系统的影响受到了越来越多的关注[5]。盐碱环境条件下的土壤含盐量和pH值比非盐碱土高，土壤盐分对微生物群落的活性、多样性和结构存在显著的影响[6]。

现有的研究证实了伴随稻田耕作年限的增加，土壤理化性质在百年至千年尺度内呈现出一定的变化规律[7]，而在百年尺度内土壤微生物群落及功能也发生了相应的变化[8]。随着盐渍化土壤种稻年限增加，耕层土壤盐分不断降低，无机氮含量不断增加，部分土壤酶活性增强[9]。真菌群落多样性随种稻年限延长而先增加后逐渐减少，种稻5 a时真菌群落多样性最高[10]。在不同稻田耕作年限序列尺度上的研究表明，土壤有机质、养分有效性及土壤微生物群落特征等在最初几十年内变化最为剧烈，在50～100 a内即可凸显人为影响下的稻田耕作年限的作用[11]。此外研究表明，随着苏打盐碱地垦殖种稻年限的增加，耕层土壤盐分不断降低，无机氮含量不断增加，部分土壤酶活性增强[12]。

土壤微生物是使土壤具有生命力的最主要成分，在土壤形成和发育过程中起着重要作用，是评价土壤质量的一个重要指标[13]。土壤微生物控制着土壤有机质的分解和转化，而不同的土地利用方式能显著影响土壤微生物的多样性[14]。国内针对盐碱土壤的微生物研究较多，康贻军等[15]研究滩涂盐碱土壤微生物生态特征；曹国栋等[16]对扇缘带盐碱土上生长的3种植物类型下的土壤微生物类群数量进行了研究；张广志等[17]在盐碱土壤鉴定出假单胞菌属和黄杆菌属；牛世全等[18]对河西走廊盐碱土细菌多样性的16S rDNA研究表明，γ-变形菌为优势菌群。然而，针对宁夏引黄灌区盐渍化土壤中的微生物种群结构、优势菌系以及土壤理化性质变化与微生物活动之间的生态关系等相关报道较少。

本试验采集宁夏平罗西大滩不同种稻年限盐渍化稻田土壤，通过高通量测序测定了土壤细菌群落结构、土壤理化性质的变化及其二者之间的关系，为揭示盐渍化稻田土壤的演变规律、为宁夏地区盐渍化土壤生物多样性现状的研究提供基础数据，并为盐渍化土壤的改良和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验区位于宁夏银北地区前进农场三站，属于贺兰山东麓洪积平原与黄河冲击平原过渡地带，地形较为平坦，平均海拔1 100 m左右。试验地土壤类型为龟裂碱土(俗称白僵土)，高度碱性，弱度盐化。一般地下水埋深1.5 m左右，地下水主要含硫酸盐、氯化物，并且普遍含有碳酸盐。土壤pH值8.5以上，碱化度20%以上，含盐量0.15%以上，盐分类型主要有NaCl、Na2SO4、Na2CO3，土壤有机质含量低，土质粘重，氮、磷含量低，钾含量较高[19]。

1.2 试验设计

田间大区对比试验设在宁夏银北地区前进农场试验基地，采样地信息见表1。以新开垦种植1 a的玉米地作为对照(旱地)，选择相邻种稻年限为0、1、6、12、21 a的盐碱地稻田土壤为研究对象。试验共设6个处理，每块稻田中随机选取3个667 m2小区，作为3个重复，每块稻田面积约为33 350 m2。供试品种为耐盐碱品种富源4号(96D10)，水稻种植方式为旱直播，播种量为337.5 kg·hm-2。播种前施足底肥，基施N15P15K15复合肥225 kg·hm-2，磷酸二铵300 kg·hm-2，苗期追肥过磷酸钙375 kg·hm-2。田间管理按常规进行。

表1 采样地信息

1.3 样品采集

于水稻生长旺季7月12日采集0～20 cm耕层土样，在距水稻根围15 cm处用钻头直径6 cm的土钻采样，采用多点采样的方法，每个试验小区随机分5点采集土样充分混匀，将新鲜土样剔除根系和碎石子后分成2份，一份低温冷藏带回实验室，在-20℃冷冻保存，用于土壤微生物的测定，另一份带回实验室风干后磨碎过2 mm筛，用于测定土壤理化性质。

1.4 土壤理化性质测定

测定土壤有机碳含量需要在加热条件下，用过量的重铬酸钾-硫酸溶液氧化土壤有机碳；全氮含量采用凯氏定氮法；土壤pH值采用酸度计法；电导率采用电导法；土壤铵态氮含量采用KCl浸提-蒸馏法测定；土壤硝态氮含量测定，称取土样10.0 g，用100 mL的2 mol·L-1KCl振荡提取土样30 min后，采用紫外分光光度法测定硝态氮含量。

1.5 土壤微生物碳测定

微生物量碳(MBC)采用氯仿-熏蒸法测定[20]。微生物碳含量为熏蒸浸提液与未熏蒸浸提液中碳含量的差值除以转换系数0.45，浸提液中的碳含量用微量有机碳分析仪(multi N/C 3100，Jena, Germany)测定。

1.6 土壤微生物群落结构测定

1.6.1 土壤DNA提取 采用Mobio公司的Power soil DNA Isolation Kit 土壤微生物总DNA提取试剂盒提取土壤微生物总DNA。对提取后的DNA产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测，合格DNA稀释至1 ng·L-1保存于-80℃用于PCR扩增。

1.6.2 PCR扩增及测序 细菌核糖体编码基因相应区段的扩增及测序服务由诺禾致源生物信息公司完成。土壤DNA提取完成后，进行16S rDNA的V4区扩增，所用引物为515F/806R(5’-GTG CCA GCM GCC GCG GTAA-3’/5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTAAT-3’)[21]。高通量测序由诺禾致源Illumina HiSeq 2500平台运行(http://www.novogene.com/index.php, Beijing，China)，最后所测得数据在250～300 bp之间产生。文库构建参照Na等[22]的方法。

1.6.3 DNA数据分析 测序原始数据的拼接、过滤、聚类分析及物种注释均参照文献[22]。其中，序列拼接利用FLASH(V1.2.7)、序列过滤利用QIIME(V1.2.7)、聚类利用UPARSE pipeline (V1.2.7)、物种注释利用RDP classifier(V2.2)软件。此外，利用QIIME计算不同样品中细菌群落的α多样性和β多样性指标[21]。

1.7 数据统计与分析

采用一元方差分析盐渍化稻田不同耕作年限对土壤各项测定指标的影响，不同耕作年限之间的多重比较采用最小显著极差法(LSD，α=0.05)。采用Mothur软件计算多样性指数(Chao-1、Shannon和Simpson指数)。皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)用于分析土壤理化性质与土壤细菌群落多样性的相关性。冗余分析(Redundancy analysis, RDA)的二维排序图能够较直观地展现土壤细菌群落与土壤其他性质之间的关系。RDA排序图中，各样方之间的线段长度代表样方之间的欧几里德距离，长度越长代表两者之间的差异越大，反之越小；土壤环境因子矢量箭头的长短代表土壤环境因子对土壤细菌群落结构的影响程度，矢量箭头越长代表影响越大。数据分析采用SPSS 20.0和CANOCO 4.5软件。

2 结果与分析

2.1 种稻年限对盐渍化土壤理化性质的影响

表2 不同种稻年限盐渍化土壤理化性质

表3 土壤理化性质间的相关系数

2.2 种稻年限对盐渍化土壤细菌群落在门水平的影响

通过对18个土壤样品的细菌群落分析，共获得高质量序列67473-84608，有效序列52179-67005，在97%相似性下测序覆盖率均在99%以上，说明测序数据量合理，能真实反应土壤微生物的群落组成。

对不同种稻年限盐碱地土壤样品中优势细菌门的分析表明，土壤中相对丰度排名前十的优势细菌分别为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)(图1)。

图1 不同种稻年限盐渍化土壤细菌各门类相对丰度Fig.1 Relative abundance of the bacterial community at thephylum level in the saline soil of different rice planting year

变形菌门是土壤中最为优势的菌群，占36.39%～53.20%。变形菌门的4个亚群的分布在不同种稻年限和旱地土壤中有显著差异(P<0.05)(图2)。种稻0 a土壤中γ-变形菌纲相对含量著高于其他样点(P<0.05)，分别高出8.96%～100.01%。拟杆菌门是第二大优势菌群，其丰度在种稻12 a和21 a土壤中含量分别为20.25%和20.43%，较其他样点分别高出47.38%～88.55%和48.76%～90.32%。放线菌门是第三大优势菌群，其丰度在种稻0年的盐渍化土壤中含量最高，为17.93%，高出其他样点52.72%～189.66%。

图2 不同种稻年限盐渍化土壤变形菌亚群分布Fig.2 Distribution of proteobacteria subgroups in thesaline soil of different rice planting year

2.3 不同种稻年限盐渍化土壤细菌群落在属水平的丰度变化

从属水平对不同样品中细菌的相对丰度变化分析表明，Buchnera在所有样点中的相对丰度都>1%，Buchnera属于变形菌门；Nitrosospira、Steroidobacter、Bryobacter在旱地土壤中的相对丰度显著高于其他样点(P<0.01)；unidentified_OM1_clade和Bacillus在盐渍化荒地土壤中(0 a)显著高于其他土壤样品(P<0.01)，相对丰度为10.26%和3.66%(表4)；Skermanella、Syntrophobacter、Pseudarthrobacter相对丰度在种稻1 a的土壤中显著高于其他土壤样品(P<0.01)；Pedobacter、Delftia、Gillisia、Azospirillum、[Desulfobacterium]_catecholicum_group相对丰度在种稻12 a的土壤中显著高于其他土壤样品(P<0.01)；Thioalkalispira、Thiobacillus、unidentified_Chloroplast相对丰度在种稻21 a的土壤中显著高于其他土壤样品(P<0.01)。

表4 不同种稻年限土壤细菌群落在属水平上的丰度变化/%

2.4 不同种稻年限盐渍化土壤细菌群落α多样性指数

不同种稻年限土壤细菌群落多样性指数Shannon、Simpson和丰富度指数Chao-1、ACE和测序深度指数Coverage如表5所示。研究表明，种稻6 a的Shannon、Chao-1和ACE指数显著高于其他种稻年限(P<0.05)。种稻12 a的Shannon、Chao-1和ACE指数显著低于其他种稻年限(P<0.05)。

2.5 不同种稻年限盐渍化土壤中细菌群落结构主成分分析

主成分分析发现，旱地和种稻1 a的土壤细菌群落结构相似；种稻6、12 a和21 a细菌群落结构相似；种稻0 a土壤和其他样地细菌群落结构差异显著(图3)。

图3 不同种稻年限土壤细菌群落结构的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of bacterialcommunity composition of saline soils in differentrice planting year

2.6 土壤细菌群落与土壤理化因子的关系

土壤细菌多样性指数和丰富度与MBC显著正相关(P<0.05)，土壤电导率和Simpson指数显著负相关(P<0.05)(表6)。

表5 不同种稻年限土壤样品α多样性分析

表6 土壤细菌多样性指数与土壤理化性状Pearson相关性分析

通过Canoco 5.0软件对环境因子和土壤细菌群落进行RDA分析。由图4可知，第一排序轴和第二排序轴分别解释了细菌群落变化的45.52%和35.98%，经过蒙特卡罗检验，土壤电导率值(F=3.7，P=0.002)、微生物碳(F=2.9，P=0.05)、硝态氮(F=3.3，P=0.02)是土壤微生物群落的主要影响因子。

图4 不同种稻年限盐渍化土壤性质与细菌群落RDA分析Fig.4 Results from redundancy analysis (RDA) to explorethe relationship between soil bacterial community andsoil physicochemical characteristics

3 讨 论

3.1 稻作年限对盐渍化土壤养分和微生物学指标的影响

本研究发现，有机质含量在旱地和种稻21 a的土壤中较盐碱荒地显著增加；微生物量碳随稻作年限延长先升高，在种稻6 a达到最高，而后有所下降；随着种稻年限延长，土壤pH值有所下降；与种稻0 a的土壤相比，耕作后土壤电导率显著下降，这主要是由于灌溉使土壤盐分迅速下降，这与周丽等[22]的研究结果相一致。这一系列变化归因于每年肥料的施用，因为研究区位于盐渍化土壤地区，植被生长量偏低，土壤有机质含量较低，肥料的施用有利于土壤有机质的增加。另外，秸秆还田也增加了土壤有机物质，进入土壤的水稻秸秆不断被分解，逐步进行矿化，秸秆中的有机物质释放到土壤中，供作物吸收利用[23]。土壤微生物生物量被认为是反映土壤质量变化的敏感性指标[11]。Li等[24]发现土壤资源有效性的增加是微生物性质改善的主要原因[24]。土壤全氮和硝态氮在旱地土壤中含量最高，这是由于长期施肥改变了土壤氮含量[25]。

3.2 稻作年限对土壤细菌群落多样性和组成的影响

农业生产使得盐渍化土壤的细菌多样性增加，在本研究中发现耕作使土壤细菌微生物多样性指数增大，这主要是由于耕作过程中改变了地表植被覆盖，作物生物量、凋落物、根系等显著高于盐渍化荒地，为土壤提供大量养分，增加了土壤碳、氮的供应，不仅改变了土壤微生物结构，提高了微生物生物量，还增加了土壤微生物多样性[26]。

细菌的变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、厚壁菌门等是农田土壤中经常被检测到的类群[27]。与大多数盐渍化土壤相似，本研究中门水平的土壤细菌以变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、绿弯菌门为主，四者含量约占总测序序列的74.4%，其中变形菌丰度最高(42.6%)。变形菌门是细菌中最大的门，其中的许多类群可以进行固氮作用，并能够适应各种复杂的环境[28]。拟杆菌门和放线菌门分别占总测序序列的14.9%和10.9%。拟杆菌门是第二大优势种群，水稻土壤中拟杆菌门土壤细菌的相对丰度显著高于其他土地类型[19]。另外，研究表明拟杆菌门对高盐环境具有较强的抗性，是盐碱土壤中的优势种群[18]，这在本研究中得到了证实。本研究发现盐渍化土壤种稻后降低了放线菌门的丰度。这与Kob⊇rl等[29]比较了埃及沙漠土壤与其临近进行农业耕作的土壤细菌群落所得到的结果相一致。他们得出耕种降低了放线菌门的相对丰度。放线菌门在采砂地中的相对丰度显著高于玉米土壤环境[30]；土壤水分是影响放线菌门的主要因子[31]。大量研究证实，放线菌门是好气性微生物，土壤含氧量较高，更适合放线菌门的生长[32]，这与本研究的结果相似。绿弯菌门相对丰度在种稻6 a和21 a土壤中显著高于其他处理，绿弯菌门是一类通过光合作用，以CO2为碳源产生能量的细菌，能在有效养分较低的条件下转化难降解的碳[33]。

在纲水平，γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)在滩涂土中有相对较高的丰度，而δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)在水稻土中更占优势，这与本研究结论一致[34]。

在属水平，旱地和种稻1 a土壤中鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的相对丰度高于其他土样，鞘氨醇单胞菌属具有解钾能力和去除难降解污染物的能力[35]，且与植物联系非常密切，在根际环境中可以分泌糖类营养物促进植物生长，这类益生菌的增加表明土壤微生态环境改善[27]。Anaerolinea(属)相对丰度在旱地和荒地土壤中都较低，随着种稻年限延长，其相对丰度逐渐增加，研究发现，Anaerolinea可以产生有机营养素、发酵有机酸、蛋白质提取物和一些碳水化合物[36]。芽孢杆菌属(Bacillusa)具有较高的抗逆性，能够在环境恶劣的条件下存活[37]，这与本研究结论一致，芽孢杆菌属的相对丰度在盐渍化荒地土壤(0 a)处理中含量显著高于其他处理。随着种稻年限延长溶杆菌属的相对丰度在逐渐上升，溶杆菌属(Lysobacter)具有拮抗多种植物病原菌功能[38]，同时溶杆菌属具有固氮功能。以往的研究表明土壤氮含量的增加可能是固氮功能菌发挥主导作用[39]。在固氮环节中Paenibacillus[40]和假单胞菌属(Pseudomonas)[41]等可将空气中的分子氮转化为有机氮，这在很大程度上增加了土壤的氮素营养，从而促进了作物增产[42]。硫化细菌属(Thiobacillus)相对丰度在种稻6、12 a和21 a的土壤中显著高于其他样品，硫化细菌可以为植物供给硫酸态硫素[43]；本研究发现亚硝化螺菌属(Nitrosospira)的相对丰度在旱地土壤中的相对丰度显著高于稻作土壤，亚硝化螺菌属的氨氧化细菌在土壤氮素循环中有重要作用[44]；Bryobacter的相对丰度在旱地和种稻1、6 a的土壤相对丰度较高，已有的研究发现Bryobacter具有分解有机质、促进土壤碳循环的功能[45]。

为了了解种稻后土壤理化性质变化对盐渍化土壤细菌群落组成的影响，本研究选择土壤有机碳、全氮、pH值、电导率、铵态氮、硝态氮和微生物碳与土壤细菌门水平相对丰度进行RDA分析。结果表明(图4)，土壤电导率、微生物碳和硝态氮对细菌群落组成影响较大。Pearson相关性分析也表明土壤电导率值与辛普森指数呈显著负相关。这表明盐分是影响不同盐碱程度土壤中微生物群落结构的显著因素，土壤电导率和pH值对盐碱土壤细菌群落结构影响最大[46]。土壤微生物对盐分变化十分敏感，当土壤盐分升高时，盐分胁迫直接改变了微生物的生存环境，造成土壤微生物渗透胁迫，抑制和降低土壤活性微生物种群数量[46]。

4 结 论

1)变形菌门、拟杆菌门和放线菌门在所有盐渍化土壤中为优势种类；布赫纳氏菌属是所有样点的优势属种。细菌群落α多样性指数在种稻12 a土壤中显著低于其他样点。其中，土壤中微生物碳和电导率值是导致种稻12 a土壤细菌群落多样性不同于其他种稻年限土壤的主要因素。冗余分析显示土壤电导率、微生物碳和硝态氮含量对盐渍化土壤细菌群落结构的影响显著。种稻时间的长短显著影响了盐渍化土壤细菌群落多样性。

2)在常年种稻和旱作条件下，土壤中固碳、固氮和溶磷功能菌大量出现，土壤理化性质变化与其相应功能菌属的变化具有相同变化趋势，表明无论是种植水稻还是旱作玉米处理都使得土壤的生物学特性优于盐渍化荒地土壤。

3)有机碳在种稻21 a的盐渍化土壤中含量最高，pH值在种稻21 a的盐渍化土壤最低；土壤电导率和微生物碳在种稻12 a的盐渍化土壤中最低。土壤微生物群落和理化性质的变化趋势显示随着种稻年限的延长，盐渍化土壤生境呈现明显的改善趋势。