中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白与基质金属蛋白酶9在不同时期COPD患者外周血中的表达变化及意义

李 果， 陈小兵， 李 刚， 梁晓彤， 陶 维， 陈绍平

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种常见的、可以预防和治疗的疾病，其特征是持续存在的呼吸系统症状和气流受限，通常与显著暴露于毒性颗粒和气体所致的气道和(或)肺泡异常有关[1]。COPD在全世界有着较高的患病率和病死率，所造成的经济和社会负担十分沉重[2]。虽然肺功能检查对于COPD的诊断和病情评估意义重大，但对疾病炎症程度、病情进展和预后判断价值有限。因此，寻找获取简单、可操作性强和具有疾病特异性的生物标志物，则可能揭示COPD病理特点、气道炎症类型和程度，可以尽早预警疾病，从而达到早期干预并改善预后的目的[3]。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)具有共同的中性粒细胞来源。有研究[4]发现在COPD急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)患者血清中，二者水平显著升高，且与吸烟指数有关，提示血清NGAL和MMP-9水平变化可以预警COPD的急性加重。本研究通过检测NGAL、MMP-9基因在不同时期COPD患者外周血单个核细胞中的表达水平并分析其临床意义，从而探讨NGAL和MMP-9作为COPD生物标志物的可能性。

1 资料与方法

1.1一般资料 前瞻性选取2016年11月至2017年7月在川北医学院附属医院呼吸与危重症医学科门诊和住院部就诊的COPD患者为研究对象。其中AECOPD患者25例(AECOPD组)，男18例，女7例，年龄50～86(72.08±8.32)岁；稳定期COPD(stable chronic obstructive pulmonary disease,SCOPD)患者80例(SCOPD组)，男50例，女30例，年龄50～85(68.16±8.23)岁。并根据患者上一年的急性加重次数(或住院次数)将SCOPD组分为低风险组和高风险组。其中，上一年急性加重0～1次(或者未住院)为低风险组，共39例；上一年急性加重≥2次(或住院≥1次)为高风险组，共41例。诊断标准：依据《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)》[5]诊断COPD。急性加重期定义为COPD患者呼吸系统症状急性恶化[如呼吸困难加重、咳嗽加剧、痰量增多和(或)呈脓性痰]，导致需要额外的治疗；稳定期定义为COPD患者呼吸系统症状稳定或轻微，病情基本恢复到急性加重之前的状态。排除标准：合并肺结核、支气管哮喘、支气管扩张、肺癌、冠心病、糖尿病、肝功能不全和肾功能不全中的任意一种疾病。选取同时期在健康体检中心参加体检者40名(对照组)，男25名，女15名，年龄48～84(63.70±10.18)岁。对照组纳入标准：胸部影像学、肺功能和相关实验室检查无明显异常，无慢性呼吸系统疾病、心脑血管疾病以及结缔组织疾病等病史。本研究已获得川北医学院附属医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。除对照组吸烟指数(smoking index,SI)明显低于AECOPD组和SCOPD组外(P<0.05)，三组性别、年龄、体质指数(Body Mass Index,BMI)比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 三组一般资料比较

1.2实验方法 收集所有受试者身高、体重、吸烟史、第一秒用力呼气容积占预计值百分比(forced expiratory volume in one second/prediction,FEV1%pred)及吸烟指数等一般信息。住院患者于入院第二日清晨、门诊患者和健康体检者于就诊当日空腹采集外周静脉血标本。于川北医学院附属医院检验科和门诊部肺功能室完成血常规和肺功能检测，检测过程质控合格。根据Gene Bank数据库中人NGAL、MMP-9及内参基因β-肌动蛋白(β-actin)的基因序列设计并合成聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)引物(上海生工生物工程有限公司)。引物序列见表2。用人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)从外周血中分离、提取单个核细胞，用Trizol(TaKaRa公司,日本)提取总RNA，选取纯度合格的RNA(OD260/OD280=1.8～2.0)，并根据逆转录试剂盒(TaKaRa公司)说明书分两步合成cDNA，最后于QuantStudioTM12K Flex实时荧光定量PCR仪(ABI公司,美国)进行实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantiative polymerase chain reaction,RT-qPCR)[6]。总反应体系20 μl，反应条件：(1)预变性95 ℃ 30 s 1个循环；(2)PCR反应95 ℃ 5 s 60 ℃ 34 s 40个循环。本研究顺利得到良好的目的基因和内参基因扩增曲线和熔解曲线。每个样品的复孔取其平均值，ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值。目的基因相对内参基因的表达量用2-ΔCt表示。

表2 人NGAL、MMP-9及β-actin基因RT-qPCR引物序列

2 结果

2.1三组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相对表达量比较 AECOPD组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量高于SCOPD组和对照组，差异有统计学意义(P均<0.01)，SCOPD组高于对照组，差异有统计学意义(P均<0.01)。见表3。

表3 三组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相对表达量比较[M(Q1,Q3)，2-ΔCt]

2.2SCOPD组内两亚组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相对表达量比较 高风险组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量均高于低风险组，差异有统计学意义(P均<0.05)。见表4。

表4 SCOPD组内两亚组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相对表达量比较[M(Q1,Q3)，2-ΔCt]

2.3AECOPD组和SCOPD组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相对表达量间的相关性 AECOPD组和SCOPD组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量间均呈显著正相关(r=0.831,P<0.01;r=0.764,P<0.01)。

2.4SCOPD组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相对表达量与FEV1%pred的相关性 SCOPD组NGAL mRNA、MMP-9 mRNA基因相对表达量与FEV1%pred均呈负相关(r=-0.416,P<0.01;r=-0.312,P<0.05)。见表5。

2.5SCOPD组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相对表达量与其他临床指标间的相关性 SCOPD组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量与外周血白细胞(white blood cells,WBC)总数、中性粒细胞(neutrophils,NEUT)总数和中性粒细胞百分比(percentage of neutrophils,NEUT%)均呈正相关，相关性均有统计学意义(P均<0.05)；与BMI、SI、第一秒用力呼气容积/用力肺活量(forced expiratory volume in one second/forced vital capacity,FEV1/FVC)等临床指标无明显相关性(P均>0.05)。见表5。

表5 SCOPD组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA相对表达量与临床指标间的相关性

3 讨论

3.1明确病因和发病机制是预防和早期诊治COPD的关键。目前对于COPD发病机制的研究仍然主要集中于炎症反应、蛋白酶/抗蛋白酶失衡和氧化应激这三个方面。中性粒细胞的活化和聚集作为这三种机制相互联系和相互作用的中间环节，在COPD发病过程中起着重要作用[7]。NGAL属于脂质运载蛋白超家族的一员，主要由中性粒细胞分泌，通常在组织损伤尤其肾脏损伤后合成增加，目前认为血清NGAL水平有望作为急性肾损伤的生物标志物[8]。既往的一些研究表明，在吸烟者肺泡灌洗液[9]、COPD患者诱导痰[10]以及动物实验时在损伤性通气策略组的肺组织[11]中，NGAL表达水平明显升高。MMP-9是一种金属蛋白酶，由活化的中性粒细胞分泌，具有降解基底膜与细胞外基质的功能。已有研究证实，NGAL在与MMP-9共价结合后，能抑制后者的水解及失活，从而延长其在胶原降解方面的作用[12]，导致肺气肿的发生。对NGAL和MMP-9基因表达水平进行联合测定，有助于深入了解二者的相互关系及其在COPD发病过程中所起的作用，对于明确COPD的发病机制有着重要指导意义。

3.2本研究显示，AECOPD组NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量高于SCOPD组和对照组，且SCOPD组高于对照组(P均<0.01)。说明与对照组相比，COPD患者NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量升高；在COPD急性加重阶段，NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量升高则更为明显。这与Eagan等[13]和Wang等[14]在COPD患者血浆中检测NGAL蛋白变化水平，以及许小毛等[15]在COPD患者中检测MMP-9基因和蛋白表达水平的队列研究结论一致。本研究还发现，SCOPD组内综合评估为高风险组的患者NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量均较低风险组患者高，差异有统计学意义(P均<0.05)。说明NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因表达水平会随着COPD急性加重风险和频率的增加而上升。戈艳蕾等[16]的病例对照研究发现，有认知功能障碍的COPD患者血浆NGAL水平升高(P<0.01)。于冰和孙艳华[17]报道COPD患者血浆NGAL水平越高，其认知功能障碍程度越重。在张子洲[18]的动物实验中，COPD大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中MMP-9的水平均显著高于正常对照组。翟梅等[19]的研究也发现，COPD合并重度和中度肺动脉高压组患者血清MMP-9水平显著高于单纯COPD组患者。上述研究结果表明，NGAL和MMP-9的基因和蛋白水平会随着COPD病情加重而升高。结合SCOPD组患者的肺功能检测结果，本研究发现NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量与肺功能FEV1%pred呈负相关，进一步说明NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因表达水平可以反映COPD病情的严重程度，提示NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量或可用来弥补肺功能检查对于AECOPD患者因不能配合和不能反映真实肺功能水平的缺陷。通过相关性分析发现，NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量与外周WBC、NEUT和NEUT%均呈正相关，考虑与NGAL和MMP-9的中性粒细胞来源有关。

3.3有研究[20]报道COPD可以通过核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)等信号通路产生肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等炎症介质，而TNF-α和IL-1β又都能诱导NGAL的表达，后者可能具有抑制细菌生长、调控炎症反应和抵御氧化应激等生物学功能。再结合NGAL和MMP-9之间能形成特异性的复合物，促进胶原降解，从而影响肺气肿的进程。故认为NGAL和MMP-9很有可能位于同一信号通路，并相互作用共同促进COPD的发病。本研究发现，无论是AECOPD组还是SCOPD组，NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量间均呈显著正相关，这再一次印证NGAL和MMP-9的共同中性粒细胞来源和其生物学功能关联的紧密性，同时也对COPD发病机制中的蛋白酶/抗蛋白酶失衡学说提供了佐证。课题组前期的配对研究结果表明AECOPD患者NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量会因并发呼吸衰竭而增加，在治疗后随着病情的改善而下降[6]。本研究发现随着COPD患者病情的急性加重和上一年的急性加重次数(或住院次数)增加，NGAL mRNA和MMP-9 mRNA基因相对表达量也随之升高。提示NGAL和MMP-9可以作为COPD急性加重的生物标志物，其基因相对表达量可以反映COPD病情严重程度，评估患者对治疗的反应以及预测再发急性加重的风险。

3.4本研究的局限性在于仅进行了基因表达水平的研究，而未能与蛋白表达的研究相结合；且AECOPD患者样本量偏少，可能存在选择偏倚，在未来的研究中应注意扩大样本量和探究基因与蛋白表达的一致性问题。关于NGAL和MMP-9在COPD病程中的变化及意义尚需更多大规模、多中心的研究来进一步证实。

综上所述，NGAL和MMP-9基因可能相互作用共同促进了COPD的发生与发展，NGAL和MMP-9在未来可能成为COPD的生物标志物，抑制NGAL和MMP-9的过表达可能为COPD的防治提供新的方法学参考。