miRNA-146a在牙周组织的抗炎作用研究

王 贺 张婷婷 周 群

牙周炎不仅是导致成年人牙缺失的主要原因，还与糖尿病、心血管疾病、肥胖等密切相关[1]。免疫炎症反应在牙周炎发生和发展过程有着重要作用[2]。微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）是一种单链、短RNA，具有21～25个核苷酸，参与调节细胞发育、分化、增殖和凋亡。既往研究表明，miRNA在多种炎症反应中均有表达[3]。miRNA-146a是第一个被发现对免疫系统有调节作用的miRNA。已有研究发现，慢性牙周炎唾液中miRNA-146a水平显著升高，且与龈沟炎症程度及牙周损伤程度呈显著正相关[4]。近年研究发现，miRNA-146a可通过负反馈调节NF-κB信号通路减轻或抑制炎症反应[5]，但其在牙周组织中的抗炎机制尚不清楚。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是牙周炎发生的主要毒力因子。牙龈成纤维细胞是牙周组织中最丰富的细胞。巨噬细胞为免疫炎症反应中重要成分。本研究以LPS诱导牙龈成纤维细胞和巨噬细胞炎症反应，探讨了miRNA-146a在牙周组织的表达及其抗炎作用机制。

一、资料和方法

1.材料

BABL/c小鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，雌性，周龄6～8周，体重20～30g；DEME高糖培养基：上海中乔新舟生物科技有限公司，货号ZQ-108；0.25%胰酶溶液：杭州吉诺生物医药技术有限公司，货号GNM-27260；脂多糖：北京索莱宝生物科技有限公司，货号L8880；miRcute miRNA提取分离试剂盒：北京天根生物科技有限公司，货号DP501；反转录试剂盒：北京百奥莱博科技有限公司，货号ALH266-DWM；SYBR Select Master Mix试剂盒：上海恒斐生物科技有限公司，货号4472908；Lipofectamine 2000：美国赛默飞公司，货号11668019；小鼠肿瘤坏死因子-α检测试剂盒、小鼠白细胞介素-1β检测试剂盒、小鼠单核细胞趋化蛋白-1检测试剂盒：上海晶抗生物工程有限公司；GAPDH抗体：上海碧云天生物科技有限公司，编号AG019；JNK抗 体、p-JNK抗 体、IRAK1抗 体、TRAF6抗体、小鼠HRP二抗：英国Abcam公司；双光束紫外可见分光光度计：上海谱元仪器有限公司，型号Alpha-1900S型；实时荧光定量PCR仪：瑞士罗氏公司，型号480；电化学发光全自动免疫分析系统：瑞士罗氏公司，型号Cobas e 601。

2.方法

（1）细胞分离与培养：采用常规方法收集小鼠牙龈成纤维细胞和腹腔巨噬细胞，置于含10%胎牛血清的DEME高糖培养基，以2×106个/孔接种于6孔板中，5% CO2、37℃恒温温箱内培养；4h后更换培养液，取贴壁细胞继续培养，隔天更换1次培养液；待细胞融合度达80%以上时，加入0.25%胰酶溶液消化细胞进行传代培养，取第4代细胞进行下一步实验。取生长状态良好的第4代细胞，以1×106个/孔接种于6孔板中，待细胞铺满孔底时，弃去培养液；加入2μg/mL的LPS溶液，每组设置3个复孔。取LPS刺激24h巨噬细胞，采用Transwell法与牙龈成纤维细胞共培养，使用0.4μm的多孔膜分离上下腔，牙龈成纤维细胞置于下腔，LPS刺激24h的巨噬细胞置于上腔。

（2）实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）：取生长良好的细胞，按照miRcute miRNA提取分离试剂盒说明书提取细胞总RNA，利用分光光度计检测RNA浓度和纯度；按照反转录试剂盒说明书将提取的RNA逆转录为cDNA；以cDNA为模板，GAPDH为内参，miRNA-146a上游引物：5＇-CACACAACGTCTCCGCTAT-3＇，下游引物：5＇-GTGCGATCCAGTCGCG-3＇，GAPDH上游引物：5＇-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3＇，下游引物：5＇-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3＇；按 照SYBR Select Master Mix试剂盒说明书配制反应体系，利用实时荧光定量PCR仪进行qRT-PCR检测；反应条件：94℃预变性5min，1个循环，94℃变性30s，57℃退火45s，30个循环，72℃延伸30s；采用2-△△Ct法分析数据，实验重复3次，取平均值。

（3）细胞转染：取生长良好的细胞，以5×104/mL接种于6孔板中，加入不含胎牛血清的DEME高糖培养基和4μL的Lipofectamine 2000转染试剂，混匀后静置5min；分别加入20nmol/L的miRNA-146a mimic和miRNA-146a count，混匀后静置20min；48h弃去转染液，加入新培养基，5%CO2、37℃恒温温箱内培养12h。

（4）酶 联 免 疫 吸 附 法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）：牙龈成纤维细胞、巨噬细胞和共培养细胞转染后，加入LPS刺激24h，收集上清液，按照试剂盒说明书操作，测定细胞培养上清液肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白 细 胞 介 素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和 单 核 细 胞 趋 化 蛋 白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）表达水平。

（5）蛋白免疫印迹法：取LPS刺激90min和4h后的巨噬细胞，转染miRNA-146a mimic和miRNA-146a count后，加入细胞裂解液，4℃离心15min，转速为13000；取上清液，依次进行琼脂糖凝脂电泳、转膜、封闭处理，TBS溶液冲洗3次，每次5min；加入c-Jun N端激酶（c-jun n-terminal kinase，JNK）抗体、磷酸化-c-Jun N端激酶（p-JNK）抗体、白介素-1受体相关激酶1（interleukin-1 receptor associated kinase 1，IRAK1）抗体、TNF受体关联因子6（tnf receptor associated factor 6，TRAF6）抗体，室温孵育1～2h，TBS溶液冲洗3次，每次5min；加入小鼠HRP二抗，室温孵育1h，TBS溶液冲洗1次；利用电化学发光全自动免疫分析系统进行拍照，以GAPDH抗体为内参参照，Image-Pro Plus软件进行灰度扫描，分析蛋白相对表达量。

3.统计学处理

二、结果

1.LPS诱导牙龈成纤维细胞和巨噬细胞miRNA-146a表达：LPS刺激24h后，牙龈成纤维细胞和巨噬细胞miRNA-146a表达水平显著升高（t＝13.453，P＜0.05）；与LPS直接刺激的牙龈成纤维细胞比较，LPS刺激巨噬细胞源性上清液可诱导牙龈成纤维细胞miRNA-146a表达增加（t＝18.462，P＜0.05，图1）。

图1 LPS诱导牙龈成纤维细胞和巨噬细胞miRNA-146a表达

2.miRNA-146a对巨噬细胞炎症因子表达的影响：LPS刺激24h后，miRNA-146a mimic转染的巨噬细胞IL-1β mRNA和MCP-1 mRNA表达水平显著低于转染miRNA-146a count的细胞（t＝32.482，P＜0.05；t＝23.471，P＜0.05），TNF-α mRNA表达水平降低，但差异无统计学意义（t＝26.987，P＝0.831，图2）。

图2 miRNA-146a对巨噬细胞炎症因子表达的影响

3.miRNA-146a对巨噬细胞IRAK1、TRAF6表达的影响：LPS刺激4h后，miRNA-146a mimic转染的巨噬细胞IRAK1和TRAF6表达水平显著低于转染miRNA-146a count的细胞（P＜0.05，图3）。

图3 miRNA-146a对巨噬细胞IRAK1、TRAF6表达的影响

4.miRNA-146a对巨噬细胞JNK磷酸化水平的影响：LPS刺激90min后，miRNA-146a mimic转染的巨噬细胞p-JNK水平显著低于转染miRNA-146a count的细胞（P＜0.05，图4）。

图4 miRNA-146a对巨噬细胞JNK磷酸化水平的影响

三、讨论

牙周炎是成年人常见的口腔疾病之一，亦是导致牙齿缺失的主要原因[6]。miRNA为体内非编码小RNA分子，对调控真核细胞基因表达、细胞发育与分化以及个体发育等具有重要价值。近年研究发现，miRNA可在转录后参与炎症和免疫反应的发生和发展[7]。人类miRNA-146a主要定位于第5号染色体上，具有高度保守性。侯云华等[8]研究发现，慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a水平显著升高。近来研究发现，miR-146a可调节先天性免疫反应，下调T细胞在炎症组织中的募集。Hessam S等[9]研究表明，miRNA-146a有可能成为某些炎性疾病潜在的生物标志物和治疗靶点。miR-146a为NF-κB炎症信号级联的负调节因子。如LPS、TNF-α等免疫和炎症因子可通过NF-κB信号通路促进miR-146a表达[10]。有研究指出，miR-146a的缺失可增加炎性巨噬细胞的迁移，加剧炎症反应[11]。另有报道指出，miR-146a的过表达可抑制巨噬细胞形成泡沫细胞和相关细胞因子的产生[12]。

以往研究表明，人炎症牙周膜干细胞中miR-146 a表达上调，miR-146 a可通过下调TLR4参与炎症牙周膜炎症反应[13]。牙周炎是一种以牙龈炎症和牙槽骨吸收为特征的慢性疾病。研究表明，宿主抵抗感染的免疫反应是导致牙周组织破坏的重要原因。巨噬细胞是宿主免疫应答的重要组成部分，具有强大的识别、吞噬、清除细菌和异物等功能。近年研究发现，巨噬细胞还具有抗炎和促溶解作用，并参与了牙周炎的发病过程[14]。LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，被认为是牙周炎发生的主要毒力因子。本研究利用LPS刺激小鼠牙龈成纤维细胞和巨噬细胞发现，LPS刺激可激活炎症相关通路，显著上调牙龈成纤维细胞和巨噬细胞miRNA-146a表达水平。同时本研究还发现，将LPS刺激巨噬细胞源性上清液与牙龈成纤维细胞共培养，可显著上调细胞miRNA-146a表达水平，提示巨噬细胞在miRNA-146a诱导中可能发挥关键作用。

TNF-α被认为是牙周组织炎症反应中重要的炎性因子，参与牙周炎的发生和发展[15]。有文献报道，LPS可通过上调单核/巨噬细胞炎症因子的表达发挥促炎作用，其中TNF-α、IL-1β和MCP-1为重要的靶向作用因子[16]。本研究将miR-146a转染到巨噬细胞中发现，LPS刺激24h后，miRNA-146a mimic转染的牙龈成纤维细胞和巨噬细胞TNF-α、IL-1β和MCP-1表达水平显著降低，LPS刺激巨噬细胞源性上清液可抑制牙龈成纤维细胞TNF-α、IL-1β和MCP-1产生，提示miR-146a可能通过抑制巨噬细胞源性TNF-α的产生以及牙龈成纤维细胞IL-1β和MCP-1的产生，发挥抗炎作用。

IRAK1是IRAK激酶家族重要组成，可调节TNF-α等炎症因子表达，参与固有免疫过程。TRAF6是一种泛素连接酶，在天然免疫中有重要作用。目前，IRAK1和TRAF6已被证实为miR-146a的重要信号分子，且受TNF-α调控[17]。有研究指出，通过抑制JNK蛋白磷酸化可减少巨噬细胞M1型极化，达到抗炎作用[18]。本研究结果显示，miR-146a转染也可导致巨噬细胞IRAK1和TRAF6表达的下调，并降低JNK磷酸化，提示miR-146a可通过下调IRAK1和TRAF6表达水平、减少JNK磷酸化，抑制巨噬细胞源性炎症因子的产生，发挥抗炎作用。