豌豆蛋白深度酶解制备咸味肽的研究

杨文君，段杉，崔春

(1.华南农业大学 食品学院，广州 510642；2.华南理工大学 食品科学与工程学院，广州 510640)

随着人们生活水平的提高以及食品工业的迅速发展，人们对调味品的要求越来越高，传统单一的调味品已经不能满足人们的要求，因此开发具有多种风味的复合调味品逐渐成为当下的研究热点，并且呈味基料在复合调味品中发挥着极其重要的作用[1]。呈味基料具有浓郁的鲜味，能提供圆润、饱满的醇厚口感，且自身也可具备特征的风味等特点[2]。目前呈味基料的制备方法主要有蛋白可控酶解法、定向合成法(主要包括化学合成、酶法合成、DNA重组技术等)以及从微生物、动植物生物体内直接提取分离纯化法等[3]。酶解法制备的呈味肽具有安全性高、生产条件温和、水解过程易控制等特点，因此酶法水解是获得食品级呈味肽的常用方法和食品领域研究的热点[4]。

豌豆(PisumsativumLinn)原产于地中海和中亚细亚地区，是我国主要的农作物之一。豌豆蛋白是豌豆的重要组成部分，氨基酸比例较为均衡，其中赖氨酸的含量丰富，同时谷氨酸、天冬氨酸等鲜味氨基酸含量也较高，是一种优质的蛋白质资源[5]，同时，也是一种制备呈味肽的良好来源。豌豆蛋白主要是生产淀粉后的副产物，以往主要用作蛋白源添加入饲料中，加工和利用未引起足够的重视，造成了蛋白资源的浪费[6-8]。近年来，利用生物酶法处理低值蛋白制备呈味肽和生物活性肽，是大宗低值蛋白深加工的一个研究热点[9]。目前已经发现的咸味肽主要是一些小分子二肽类，这些二肽类物质(如γ-Glu-Phe和γ-Glu-Tyr)不仅具有咸味，由于其富含的γ-Glu还使得其具有鲜味与轻微酸味[10]。Toelstede等[11]的研究表明奶酪中含有L-Arg的多肽也具有咸味增强作用。此外，咸味肽对于糖尿病、心血管疾病、高血压等需要低钠饮食的特殊人群有着重要的功能价值，Zhu等[12]从无盐酱油中分离出的二肽不仅具有咸味，而且可以通过抑制ACE而达到降血压的目的。本研究以豌豆蛋白为原料，通过单因素实验对豌豆蛋白风味蛋白酶酶解工艺进行优化，分析最佳酶解工艺产物的肽分子量分布、氨基酸组成等特性，以期为豌豆蛋白制备咸味肽的深入研究提供理论与技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料与试剂

豌豆蛋白粉：山东六六顺食品有限公司；风味蛋白酶、37071碱性蛋白酶：诺维信(中国)生物技术有限公司；胰酶：全新祥盛生物科技有限公司；50 C、Umami G鲜味酶：天野酶制剂(江苏)有限公司；菠萝蛋白酶：重庆骄王天然产物股份有限公司；氢氧化钠、盐酸、硫酸钾、甲醛等常用化学试剂(均为分析纯)：天津市大茂化学试剂厂；乙腈(色谱纯)：科密欧化学试剂有限公司；三氯乙酸(色谱纯)：上海阿拉丁公司；肽分子量标品(牛血清蛋白、细胞色素C、抑肽酶、杆菌肽、Gly-Gly-Gly，色谱纯)：美国Sigma公司。

1.1.2 仪器与设备

THZ-C台式恒温振荡器 太仓市华美生化仪器厂；KDN-103F微量凯式定氮仪、KDN-40八孔消化炉 上海纤检仪器有限公司；Scientz-18N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技有限公司；雷磁PHS-3E pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；GL-21M型高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；LC-15C液相色谱仪 岛津实验器材有限公司。

1.2 豌豆蛋白深度酶解工艺优化

1.2.1 豌豆蛋白酶解产物的制备

豌豆蛋白粉→加水摇匀(料液比为1∶9)→调节pH(0.1 mol/L KOH溶液)→酶解一定时间→灭酶(沸水浴10 min)→离心(8000 r/min，15 min)→取上清液→豌豆蛋白酶解产物→冷冻干燥备用。

1.2.2 不同蛋白酶对豌豆蛋白酶解的影响

称取10 g豌豆蛋白粉，加入90 g的水溶解，用1 mol/L KOH溶液分别将豌豆蛋白水溶液调节pH至6种蛋白酶的最适pH，分别加入豌豆蛋白质量0.1%的风味蛋白酶、37071碱性蛋白酶、胰酶、50 C、Umami G鲜味酶、菠萝蛋白酶置于50 ℃空气摇床分别水解3，6，9，12，24 h后离心得到豌豆蛋白酶解液。测定不同种类蛋白酶对豌豆蛋白深度酶解的影响，进而筛选出一种效果较好的蛋白酶进行后续的工艺优化。

续 表

1.2.3 酶解温度对豌豆蛋白酶解的影响

称取10 g豌豆蛋白粉，加入90 g的水溶解，用1 mol/L KOH溶液将豌豆蛋白水溶液调节pH至8.0，加入豌豆蛋白质量0.1%的风味蛋白酶，分别置于45，50，55，60 ℃的空气摇床中水解24 h后离心得到豌豆蛋白酶解液。测定不同酶解温度对豌豆蛋白深度酶解的影响。

1.2.4 酶解pH对豌豆蛋白酶解的影响

称取10 g豌豆蛋白粉，加入90 g的水溶解，用1 mol/L KOH溶液将豌豆蛋白水溶液调节pH至7.0，8.0，9.0，10.0，加入豌豆蛋白质量0.1%的风味蛋白酶，置于50 ℃的空气摇床中水解24 h后离心得到豌豆蛋白酶解液。测定不同pH对豌豆蛋白深度酶解的影响。

1.2.5 总氮和氨基酸态氮含量的测定

总氮含量根据GB 5009.5-2010测定。氨基酸态氮含量采用甲醛滴定法测定[13]。

1.2.6 水解度和蛋白质回收率的计算[14]

1.2.7 酶解产物肽分子量分布的测定

将豌豆蛋白水解液冻干样品加水稀释至蛋白浓度为10 mg/mL，采用高效液相色谱测定酶解液中肽分子量分布情况，凝胶柱型号为TSK gel G2000 SWXL分析柱，流动相为乙腈∶水∶TFA为25∶75∶0.1，流速为0.5 mL/min，检测波长为220 nm。标准肽样品分别为：牛血清蛋白(68000 Da)、细胞色素C(12384 Da)、抑肽酶(6511 Da)、杆菌肽(1423 Da)、Gly-Gly-Gly(189 Da)。以保留时间x为横坐标，相对分子质量的对数y为纵坐标，绘制相对分子质量校正曲线并得到方程：y=-0.288x+8.1408，R2=0.985。

1.2.8 酶解产物氨基酸组成分析

参照孙媛媛等[15]的方法并加以修改，准确称取0.1 g样品，在水解管中加入6 mol/L盐酸5 mL，封口，然后放在(110±1) ℃的恒温干燥箱内水解24 h，取出冷却。打开水解管，过滤水解液，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50 mL容量瓶中定容。吸取1～2 mL定容后的样品，置于60 ℃恒温干燥箱中脱酸。向脱酸后的样品中加入1～3 mL缓冲液，均匀振荡，用注射器吸取少量，过0.22～0.45 μm滤膜后装入样品瓶中上机分析。

1.2.9 酶解产物感官评定

参照GB/T 16291.1-2012和刘通讯等[16]的方法进行感官评价分析。感官评价小组包括5男5女，年龄在16～25岁，感官评价室的温度为(24±1) ℃。感官评定员在感官评定之前经过基本滋味培训，熟悉豌豆酶解产物的风味特征和感官强度，进行培训的标准品分别是甜味(1%蔗糖)、咸味(0.35%食用盐)、鲜味(0.2%味精)、苦味(0.02 g/L盐酸奎宁)、酸味(0.04%柠檬酸)。样品溶液取10 mL置于杯中，评定员将样品溶液全部倒入口中，并保持10 s左右，随后将其吐出。感官评定使用评分法，0～9分制(0～1：无感觉，2～3：阈值感觉，4～5：感觉微弱，6～7：感觉中等，8～9：感觉强烈)，用雷达图表示定量描述分析结果[17]。

2 豌豆蛋白深度酶解工艺单因素实验结果与分析

2.1 不同蛋白酶对豌豆蛋白酶解的影响

蛋白质经深度酶解后会产生游离的呈味氨基酸和呈味肽，大量实验表明，在一定时间范围内水解时间越长，水解度越高，水解产物所表现出的呈味强度越高[18]。本实验选取了6种不同的蛋白酶水解豌豆蛋白并对其水解度、蛋白回收率和感官进行了评价，从而筛选出水解效率最高的酶。

由图1可知，6种蛋白酶对豌豆蛋白溶液均产生了不同程度的水解，Umami G鲜味酶、风味蛋白酶、胰酶的效果较为明显。在酶解3～24 h内，酶解时间越长，水解度和蛋白回收率越高；在水解24 h后，Umami G鲜味酶水解度最高，风味蛋白酶次之，分别达到了37.56%和20.21%。Umami G鲜味酶蛋白回收率最高，胰酶和风味蛋白酶次之，分别达到了71.04%、67.29%和59.44%。由1中C可知，感官评价显示风味蛋白酶酶解产物的咸味和鲜味最为突出，其他几种酶均表现出明显的苦味，胰酶尤为明显。综合考虑水解效率、感官评价这两种指标，选择风味蛋白酶进一步研究酶解效果。

图1 不同蛋白酶对豌豆蛋白酶解的影响Fig.1 Effect of different proteases on pea protein hydrolysis

2.2 酶解温度对豌豆蛋白酶解的影响

由图2中A可知，酶解24 h后，豌豆蛋白酶解液的水解度和蛋白回收率都随着温度的升高先增大后减小，在酶解温度为50 ℃时水解度和蛋白回收率均达到最高，分别为19.12%和48.88%。由图2中B可知，感官评价显示在50 ℃时豌豆蛋白酶解液的鲜味和咸味最明显，这一结果与张典等[19]研究的温度对风味蛋白酶酶解牡蛎的影响基本一致。因此，选取50 ℃为风味蛋白酶的最适温度。

图2 酶解温度对豌豆蛋白酶解的影响Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on pea protease hydrolysis

2.3 pH对豌豆蛋白酶解的影响

pH的调控在蛋白体系酶解中发挥着非常关键的作用，通过影响酶分子的结构稳定性和底物的解离，进而影响酶解效率[20]。

由图3中A可知，随着pH的增大，豌豆蛋白酶解液的水解度和蛋白回收率随之减小，在pH为7.0时，水解度和蛋白回收率分别达到最大值22.63%和58.08%。由图3中B可知，感官评价显示在pH为7.0时豌豆蛋白酶解液的鲜味和咸味最明显，这表明风味蛋白酶在较佳pH下促进蛋白质降解产生肽和氨基酸，增加了产品的滋味和香气。因此，选取pH 7.0为风味蛋白酶的最适pH。

图3 酶解pH对豌豆蛋白酶解的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis pH values on pea protease hydrolysis

2.4 豌豆蛋白酶解产物肽分子量分布

采用高效液相色谱法测定豌豆蛋白酶解产物的肽分子量分布，由表1可知，在最佳酶解条件下对豌豆蛋白分别水解不同时间得到的酶解产物的相对分子量主要集中在5 kDa以下的肽段范围内(>60%)，并且随着酶解时间的延长，大分子肽段(1～50 kDa)含量减少，小分子肽段(0.5～1 kDa)含量增加。其中在酶解24 h的样品中<1 kDa的肽段达到了65.60%，说明在24 h后豌豆蛋白经深度酶解得到了一系列的小分子肽。根据文献报道分子质量<3 kDa的小分子肽对食品的滋味有重要影响，是食品滋味的重要贡献者[21]。

表1 豌豆蛋白酶解产物肽分子量分布Table 1 The molecular weight distribution of peptides of pea protein hydrolysates

2.5 豌豆蛋白深度酶解产物氨基酸组成分析

由表2可知，豌豆蛋白深度酶解产物中游离氨基酸种类齐全，富含高达39.16%的人体和动物必需的氨基酸，营养价值较高。其中鲜味氨基酸和甜味氨基酸(主要是谷氨酸和天冬氨酸)是良好呈味基料的基础，且含量分别达到36.79%和15.03%。在整体感官评价中，也证明了酶解产物具有显著的鲜味和鲜味特征，为开发制备高品质调味品奠定了良好的基础。

表2 豌豆蛋白酶解产物氨基酸组成分析

3 结论

通过单因素实验，以水解度、蛋白回收率和感官评分为指标，确定豌豆蛋白深度酶解最佳工艺条件为：风味蛋白酶酶解温度50 ℃，酶解pH 7.0，酶解时间24 h。在最佳酶解工艺下对豌豆蛋白进行深度酶解，酶解液水解度达到22.63%，蛋白回收率达到58.08%，感官评价显示具有显著的鲜味和咸味。所获得的豌豆蛋白深度酶解产物中分子量<1 kDa的小分子肽含量为65.60%。豌豆蛋白深度酶解产物游离氨基酸中必需氨基酸含量为39.16%，鲜味氨基酸含量为36.79%，甜味氨基酸含量为15.03%。本研究通过一系列的条件探索，最终得到了豌豆蛋白酶解的最佳条件，从而得到一种具有良好呈味特性的小分子肽混合物，并且通过测定豌豆蛋白酶解产物的水解度、蛋白回收率、感官分析、氨基酸分析和肽分子量分布等特性对呈味特性进行了评价，为进一步提高豌豆蛋白的利用率提供了数据支持，为以咸味肽为基料制备高级调味品奠定了良好的基础。