氟离子和碳酸氢根对构树幼苗生长和碳代谢的影响*

姚 凯 吴沿友

(1.贵州师范大学生命科学学院 贵阳 550025；2.中国科学院地球化学研究所 环境地球化学国家重点实验室 贵阳 550081)

氟离子主要通过植物根系吸收，并在木质部随蒸腾流向上运输，最后储藏积累在各器官(主要为叶片)中，抑制光合作用、呼吸作用以及其他代谢过程关键酶，影响植物生长代谢并最终导致植物死亡(Miller,1993;Fornasiero,2003;Elloumietal.,2005)，对早期幼苗的伤害作用尤为强烈(利锋,2004;Weinsteinetal.,2004)。此外，氟中毒引起机体显著的氧化应激反应，产生大量自由基和活性氧(ROS)，增加膜脂质过氧化，并破坏胞内蛋白酶的结构(Izquierdo-Vegaetal.,2008;Barbieretal.,2010;Gutowskaetal.,2010)。而各种蛋白酶在植物光合、清除ROS系统和糖代谢过程中具有重要作用。在光合系统中，除核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco,EC 4.1.1.39)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC,EC 4.1.1.31)等固定CO2的羧化酶以外，碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA,EC 4.2.1.1)等非直接固碳的酶也是不可或缺的。CA是催化CO2可逆水合反应的一类含锌金属酶。在光合过程中，CA加速无机碳向羧化酶活性部位扩散以增强CO2的固定速率(蒋春云等,2013)。CA对陆地植物利用碳酸氢盐具有重要的作用，特别是植物气孔开放受环境因子限制时，CA被迅速激活(吴沿友等,2011)。逆境中的植物可通过葡萄糖代谢途径的调控来响应环境变化，并保持生长生理活性。植物葡萄糖代谢途径的调控可体现在葡萄糖通过磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)和糖酵解途径(glycolytic pathway,EMP)代谢的份额变化。PPP途径和EMP途径是生物体糖代谢系统的核心。已有研究表明，在非生物胁迫下，葡萄糖代谢从EMP途径转移到PPP途径(Yuetal.，1967；Lietal.,2011;Liuetal.,2013)。PPP途径的激活可产生大量NADPH，为维持抗氧化酶活性提供还原力；同时增强核酮糖-5-磷酸(RuMP)的再生以促进Calvin-Benson循环。磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK,EC 2.7.1.11)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PDH,EC 1.1.1.49)分别是EMP途径和PPP途径的限速酶，控制着葡萄糖通过这2种途径的代谢份额。

金属离子是金属酶活性中心的重要组成部分，氟元素易与带正电的金属离子形成不溶络合物，所以能抑制许多金属酶的活性。长时间高浓度的氟处理可强烈抑制植物呼吸作用过程中的酶活性，并不可逆地损害线粒体的结构甚至使其功能完全丧失(Yuetal.,1967;Lietal.,2011)；另一方面，氟离子能与围绕酶活性中心的氨基酸官能团结合，使酶的构象发生变化而失活(Chlubeketal.,2003;Chlubek,2003)。NaF也常被用为EMP途径的抑制剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料与培养

选取喀斯特适生树种构树为研究对象，种子收集于中国科学院地球化学研究所老园区。选取籽粒饱满的种子，置于盛有珍珠岩的育苗盒中，种子上覆盖薄层珍珠岩，育苗盒中注入适量的蒸馏水，以不浸泡种子为宜。光照培养箱的温度设置为25 ℃、光周期为12 h。种子在播种后12天开始萌发，幼苗出现4片真叶后，选取健壮的幼苗移栽。移栽后每个育苗盒栽培2株幼苗，并保持适当间距以保证幼苗生长至适合试验大小时不互相遮盖光照。将移苗后的育苗盒置于人工气候室内，设置光周期为12 h，光照强度为300 μmol·m-2s-1，日间气温为25 ℃，夜间气温为20 ℃，相对湿度为55%～65%。添加1/2浓度的Hoagland营养液为构树幼苗提供营养和水分。

1.2 试验处理

待植株高度达到12～13 cm时，选取生长均一的幼苗进行试验(表1)。在营养液中加入NaF和NaHCO3制成处理液，本试验共有4个处理组，即对照组、3 mmol·L-1NaF处理组、3 mmol·L-1NaHCO3处理组和3 mmol·L-1NaF+3 mmol·L-1NaHCO3处理组。因试验大背景为喀斯特生境，故各组处理液的pH值均调为7.8。隔天在固定时间更换处理液。第0 天和第6天时，测量植株的各项生长指标。因宽度在70 mm左右的叶片生长活性较强且数量较多，故以此标准采集叶片为样品，-80 ℃冷冻保存，用于测试植株叶片的各项生理生化指标。所有指标均设置5个重复。

表1 处理前构树的生长指标①Tab.1 The growth parameters of Broussonetia papyrifera before treatments

1.3 植株生长参数测定

处理后，分别于第0天和第6天测量植株的生长指标。选取株高(H)、基径(Db)、叶片数(N)和叶宽≥70 mm的叶片数(N70)作为衡量植物生长的指标。

1.4 构树叶片中酶液的提取

根据Liu等(2013)的方法并稍作修改，提取叶片中的酶。取0.1 g的构树叶片置于冰浴研钵中并加入液氮研磨。待液氮挥发后，加入1 mL酶提取液，其中含有50 mmol·L-1HEPES Tris-HCl(pH7.8)，3 mmol·L-1MgCl2，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1二硫苏糖醇和1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟。把研磨后的匀浆移入离心管中，在4 ℃下，12 000×g离心20 min，取上清液冷藏待测。

1.5 构树叶片中G6PDH酶活性测定

根据Tian等(1998)的方法并稍作修改，测定G6PDH酶活性。首先测定G6PDH和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH,EC 1.1.1.44)的总活性，把200 μL酶提取液加入到1.8 mL G6PDH和6PGDH总酶活性分析液中以测定G6PDH和6PGDH的总活性。G6PDH和6PGDH总酶活性分析液中含有50 mmol·L-1HEPES Tris-HCl(pH7.8)，3.3 mmol·L-1MgCl2，0.5 mmol·L-16-磷酸葡萄糖酸酯二钠盐，0.5 mmol·L-16-磷酸葡萄糖酸酯和0.5 mmol·L-1NADPNa2。把200 μL酶提取液加入到1.8 mL 6PGDH酶活性分析液中以测定6PGDH的酶活性。6PGDH酶活性分析液中含有50 mmol·L-1HEPES Tris-HCl(pH7.8)，3.3 mmol·L-1MgCl2，0.5 mmol·L-16-磷酸葡萄糖酸酯和0.5 mmol·L-1NADPNa2。用紫外分光光度计测定反应混合液在340 nm处的光吸收，以测量反应混合液中NADP+还原为NADPH的速率的变化。G6PDH酶活性的值等于G6PDH和6PGDH总酶活性值减去6PGDH酶活性值。

1.6 构树叶片中PFK酶活性测定

根据Carnal和Black(1983)的方法并稍作修改，测定PFK的活性。PFK酶活性等于ATP-PFK酶活性加上焦磷酸(PPi)-PFK酶活性。为测定ATP-PFK酶活性，把200 μL酶提取液加入到1.8 mL ATP-PFK酶活性分析液中，分析液中含有50 mmol·L-1HEPES Tris-HCl(pH7.8)，2.5 mmol·L-1MgCl2，0.1 mmol·L-1NADH，5 mmol·L-1果糖-6-磷酸，2 U·mL-1醛缩酶(aldolase,EC 4.1.2.13)，1 U·mL-1丙糖磷酸异构酶(triose-phosphate isomerase,TPI,EC 5.3.1.1)，2 U·mL-13-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH,EC 1.2.1.12)和1 mmol·L-1ATP；为测定PPi-PFK酶活性，把200 μL酶提取液加入到1.8 mL PPi-PFK酶活性分析液中，分析液中含有50 mmol·L-1HEPES Tris-HCl(pH7.8)，2.5 mmol·L-1MgCl2，0.1 mmol·L-1NADH，5 mmol·L-1果糖-6-磷酸，2 U·mL-1醛缩酶，1 U·mL-1TPI，2 U·mL-1GAPD和1 mmol·L-1PPi。用紫外分光光度计测定反应混合液在340 nm处的光吸收，以测量反应混合液中NADH氧化为NAD+的速率的变化。

1.7 葡萄糖通过EMP途径和PPP途径代谢的比例计算

计算出PFK酶活性为EApfk，G6PDH酶活性为EAg6pdh，同时假设生物体内参与葡萄糖代谢的代谢途径的关键酶的总活性为EA∑，除EMP途径和PPP途径之外参与葡萄糖代谢的各途径的限速酶活性为EAelse，且各途径的限速酶的活性代表了各途径葡萄糖代谢的份额。则生物体内葡萄糖通过EMP途径代谢的占比PEMP可表示为：

PEMP=EApfk/(EApfk+EAg6pdh+EAelse)×100% 。

(1)

同理，PPP途径在葡萄糖代谢中的占比PPPP可表示为：

PPPP=EAg6pdh/(EApfk+EAg6pdh+EAelse)×100% 。

(2)

在植物细胞中，约75%的葡萄糖通过EMP代谢，15%～30%的葡萄糖通过PPP代谢(Copelandetal.，1987；Debnametal.，2004),EAelse的占比很小；且在本文中只研究PFK和G6PDH的酶活性关系，所以在式1和式2中，EAelse可忽略。葡萄糖通过EMP途径代谢与通过PPP途径代谢的份额比可简单表示为：

P=PEMP∶PPPP=EApfk∶ EAg6pdh。

(3)

1.8 构树叶片中CA的提取及活性测定

按照吴沿友等(2011)的方法测定CA的活性。称取0.1 g左右鲜质量的构树叶片，置于冰浴的研钵中并加入液氮研磨，再加入3 mL的CA提取液(pH8.30)，其中含有0.01 mol·L-1巴比妥钠、0.05 mol·L-1巯基乙醇，持续研磨至匀浆。把叶片匀浆转移到5 mL的离心管中，4 ℃下，12 000×g离心5 min，取上清液置于离心管中，冷藏待测。CA活性的测定方法如下：将测定的反应系统置于0 ～ 2 ℃的低温环境中，取CA提取液400 μL，加入到反应液中，反应液为4.5 mL巴比妥钠缓冲液(20 mmol·L-1，pH8.30)，同时加入3 mL预冷温度为0 ～ 2 ℃的饱和CO2蒸馏水。用pH锑电极测量整个反应体系中的电位变化并记录电位随时间变化的过程曲线，根据该时间-电位曲线得到添加CA提取液和空白条件下反应体系内单位电位值下降的时间t和t0。t0为空白处理所需的时间，t为样品所需的时间。CA活性单位为WAU·g-1，其计算公式为WA=(t/t0-1)。

1.9 数据统计与分析

利用统计分析软件SPSS(20.0版本)对不同处理水平间试验数据进行单因子显著性差异分析(P≤ 0.05)。插图均用Origin(9.0版本)软件绘制。

2 结果与分析

2.1 NaF和NaHCO3处理对构树生长指标的影响

测量植株地上部分的各项生长指标以评估构树在NaF和NaHCO3处理下的生长情况(表2)。较之对照组，营养液中添加3 mmol·L-1NaF的处理下构树的H和Db的增长均受严重抑制，N和N70也停止增长。在添加3 mmol·L-1NaF+ 3 mmol·L-1NaHCO3处理组中，植株的各项生长指标也受到严重抑制，但抑制程度与单独添加NaF组相比较低。4个处理组中，植株的生长情况在添加3 mmol·L-1NaHCO3处理组最好，各项生长指标均略高于对照组。

表2 NaF和NaHCO3处理下构树的生长和光合指标Tab.2 The growth and photosynthetic parameters of Broussonetia papyrifera under NaF and NaHCO3 treatments

2.2 NaF和NaHCO3处理对PFK酶活性的影响

处理6天后，各处理组ATP-PFK和PPi-PFK的酶活性及PFK酶的总活性如图1所示。在3 mmol·L-1NaF处理组，构树叶片中ATP-PFK酶活性下降到对照组的66%左右，而PPi-PFK的酶活性下降到对照组的16%左右；在3 mmol·L-1NaHCO3处理组，ATP-PFK酶活性为对照组的110%，PPi-PFK酶活性上升到对照组的161%左右；在3 mmol·L-1NaF+3 mmol·L-1NaHCO3处理组，ATP-PFK和PPi-PFK的酶活性分别为对照组的122%和39%，为NaHCO3处理组的111%和24%，为NaF处理组的185%和241%。

图1 不同处理组构树叶片中ATP-PFK (A)、PPi-PFK (B)和PFK (C)酶活性的变化Fig.1 The activities of ATP-PFK (A),PPi-PFK (B)and PFK (C)in leaves of Broussonetia papyrifera seedlings under different treatments不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant differences between treatments (P<0.05).The same below.

PFK酶总活性在3 mmol·L-1NaF处理组仅为对照组的47%左右；在3 mmol·L-1NaHCO3处理组，PFK酶活性最高，为对照组的129%左右。而在3 mmol·L-1NaF+3 mmol·L-1NaHCO3处理组中，PFK的酶活性分别为对照组的90%、NaHCO3处理组的70%、NaF处理组的193%。

2.3 NaF和NaHCO3处理对G6PDH酶活性的影响

由图 2可知，在3 mmol·L-1NaF处理组，构树叶片中G6PDH酶活性上升为对照组的157%；3 mmol·L-1NaHCO3处理组G6PDH酶活性为对照组的87%；3 mmol·L-1NaF+3 mmol·L-1NaHCO3处理组的G6PDH酶活性分别为对照组的145%、NaHCO3处理组的167%、NaF处理组的92%。

图2 不同处理组构树叶片中G6PDH酶活性的变化Fig.2 The activities of G6PDH in leaves of B. papyrifera seedlings under different treatments

2.4 NaF和NaHCO3处理下构树叶片中葡萄糖代谢途径的转移

如图3所示，在对照组中，葡萄糖通过EMP途径代谢所占的比例(PEMP)为70%，通过PPP途径代谢的比例(PPPP)为30%；3 mmol·L-1NaHCO3处理组，PEMP和PPPP分别为78%和22%；3 mmol·L-1NaF的处理组，PEMP下降到42%，PPPP上升为58%；而在3 mmol·L-1NaF+3 mmol·L-1NaHCO3处理组，PEMP和PPPP分别为60%和40%。同时，各处理组的糖代谢总量排序为：NaF处理组<对照组

图3 不同处理组构树叶片中葡萄糖代谢途径的歧化状况Fig.3 Disproportionation of glucose metabolism in leaves of B. papyrifera seedlings under different treatments

2.5 NaF和NaHCO3处理对CA酶活性的影响

各处理组CA酶活性如图4所示。在3 mmol·L-1NaF处理组，构树叶片中CA酶活性为对照组的98%；3 mmol·L-1NaHCO3处理组中叶片CA酶活性为对照组的287%；3 mmol·L-1NaF+3 mmol·L-1NaHCO3处理组CA酶活性分别为对照组的107%、NaHCO3处理组的37%、NaF处理组的109%。

图4 不同处理组构树叶片中CA酶活性的变化Fig.4 The activities of CA in leaves of B. papyrifera seedlings under different treatments

3 讨论

在营养液中添加3 mmol·L-1NaF对构树生长产生显著的抑制作用，株高、基径和叶片数等指标均显著低于对照组。与环境因子胁迫会诱导植株某些器官生长增加不同，F-对植株各部分生长都显著抑制，且叶片颜色较对照组明显偏黄。有研究表明，F-在植物叶片中易与Mg2+结合形成MgF+络合物从而显著降低光合色素(特别是叶绿素)的浓度(Trappetal.,1995;Deyetal.,2012)，导致叶片颜色偏黄并使植物的光合能力显著下降，因此植株各个器官的生物量积累和生长都会受到抑制。通过对植株光合指标的研究也发现，F-处理显著抑制植株的Pn和gs。此前也有研究报道，氟化物能够通过抑制Rubisco酶活性使植物的碳同化能力受到抑制(徐丽珊等，2003)。通过研究构树叶片中PFK酶活性发现，F-对ATP-PFK和PPi-PFK的活性都产生了抑制作用，其中，对PPi-PFK的抑制作用尤为强烈。同时，G6PDH酶活性受到F-处理激活。NaF处理抑制EMP途径并激活PPP途径现象与其他学者的研究结果(Yuetal.，1967；Lietal.,2011)一致。PPP途径的激活可为清除F-胁迫下植物产生的过量ROS物质提供更多的还原力，对维持细胞结构的完整和代谢酶的活性具有重要的作用。

4 结论