基于网络药理学和分子对接技术探究红花治疗缺血性脑卒中的作用机制

梁瑞敏，王 凯，陈 悦，曹金一，乔 逸，冯智军，杨志福*

1陕西中医药大学药学院，咸阳 712046；2空军军医大学西京医院药剂科，西安 710032

近年来缺血性脑卒中的致残率和死亡率持续上升[1]。缺血性脑卒中是最常见的中风类型，发生在颈部或脑部血管阻塞时，导致脑组织局部缺血缺氧，引起脑组织软化甚至坏死的神经系统疾病[2]。目前西医治疗缺血性脑卒中的方法有抗血小板治疗、急性期降压处理及去血肿颅骨切除术、脑室内置管引流术、微创穿刺血肿清除术等[3,4]。这些方法迅速、有效，但也伴随一些副作用，如术后再出血、感染及神经损伤、脑灌注压不足等风险。目前中药改善缺血性脑卒中的主要作用包括对抗缺血性脑卒中后的细胞凋亡，减少出血量，同时缓解脑血管痉挛、脑水肿以及神经功能障碍等并发症，进而降低炎性反应。

红花为菊科红花CarthamustinctoriusL.的干燥花，具有活血通经，散瘀止痛之效[5]。其主要化学成分有黄酮类、甾体类、酚酸类、木脂素、查尔酮和挥发油等[6]。近年来红花抗缺血性脑卒中的作用受到关注，其主要通过抑制自由基的产生、抑制血栓形成、抑制细胞凋亡与炎性反应、保护神经细胞、抗氧化能力以及通过调节一些信号通路等发挥脑保护作用[5,8]。但是，中药发挥疗效具有多成分、多靶点的特点，因此红花抗缺血性脑卒中的机制也是多方面的，但现阶段缺乏对红花抗缺血性脑卒中的药效成分及作用机制的整体认识。因此，本研究采用网络药理学和分子对接技术相结合的方法，通过构建“红花-活性成分-脑缺血共同靶点”三者间网络关系，并对红花抗缺血性脑卒中疾病中作用较强的靶点进行验证，从整体角度阐述红花抗缺血性脑卒中的复杂关系，进而说明红花多成分、多靶点、多通路的药理作用机制。

1 资料

本研究使用的数据库及软件相关信息(见表1)。

表1 数据库及软件相关信息

2 方法

2.1 收集红花活性成分、潜在靶点及转换基因名

登录中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)，选择“Herb name”，输入“honghua”进行检索，以化合物口服药物生物利用度(oralbioavail ability，OB)和类药性(drug-like，DL)为标准，设置OB≥30%，DL≥0.18，将符合条件的成分导入Excel表，即得红花活性成分。研究表明红花中的活性成分羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)，对缺血性脑卒中具有神经保护作用[9-12]。因此将HSYA也列在其中。将红花活性成分对应的靶点导入Uniprot数据库中进行基因名的转换，去除重复后获得红花活性成分对应的基因名。

2.2 筛选缺血性脑卒中疾病靶点

利用人类基因(Genecards)、人类孟德尔遗传(OMIM)数据库，以“ischemic stroke”作为关键词检索，去除重复后，得到与缺血性脑卒中相关靶点。从中筛选出评分大于15的缺血性脑卒中疾病靶点进行分析。

2.3 获取共同靶点

将红花活性成分对应靶点与缺血性脑卒中疾病对应靶点导入在线Venny中，绘制韦恩图，得到红花作用靶点与缺血性脑卒中疾病靶点的交集，即共同靶点。获得红花潜在治疗缺血性脑卒中疾病作用靶点。

2.4 构建PPI网络及筛选核心靶点

将Venny中筛选到的共同靶点，导入STRING数据库，选择“Homo sapiens”，隐藏离散节点，得到蛋白质之间的相互作用关系，获得PPI网络中的关键节点基因。利用Cytoscape 3.7.2将关键节点基因按degree值排列，绘制相关靶点网络图，并构建“红花-活性成分-脑缺血共同靶点”三者间网络关系图，该网络中有10个化合物能与5个及以上靶点发生相互作用。

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析

将共同靶点导入DAVID数据库，构建可视化网络。选择“Homo sapiens”，进行GO功能和KEGG通路富集分析，设定P-value ≤0.05，筛选出符合条件的条目，对其进行可视化分析。GO富集分析主要包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞成分(cellular component，CC)相关过程，这些参与红花治疗缺血性脑卒中的整个过程。KEGG富集分析主要对信号通路进行富集，筛选出红花治疗缺血性脑卒中最可能的信号通路。

2.6 分子对接验证

选择共同靶点中degree值排名较高的靶点基因与“红花-活性成分-脑缺血共同靶点”网络中排名靠前的活性成分进行分子对接。从TCMSP数据库获取红花活性成分的分子结构mol2格式，在RCSB PDB数据库将对应靶点基因转换成3D分子结构pdb格式。通过Pymol 2.5.0对分子进行去水和剔除修饰配体，利用AutoDock Tools 1.5.6将红花活性成分和靶点基因转换为pdbqt格式。最后采用AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接，通过Pymol 2.5.0获得化合物的优势构象，运用Discovery Studio Visualize将分子对接得分较高且构象较稳定的化合物与靶点基因进行可视化分析。

3 结果

3.1 红花活性成分

通过筛选获得红花活性成分23种(见表2)。

表2 红花23种活性成分信息表

续表2(Continued Tab.2)

3.2 获取共同靶点

将23种红花活性成分对应的靶点去除重复后导入Uniprot数据库转换基因名，共获得459个靶点，利用Genecards数据库筛选出评分大于15的缺血性脑卒中疾病靶点249个，在Venny中取交集得74个红花潜在治疗缺血性脑卒中疾病的作用靶点(见图1)。

图1 红花与缺血性脑卒中靶点韦恩图Fig.1 Wain diagram of the targets of safflower and ischemic stroke

3.3 构建“红花-活性成分-脑缺血共同靶点”网络图及核心靶点筛选

将74个共同靶点导入STRING数据库，选择“Homo sapiens”，得到各靶点间相互作用网络图(见图2)。将STRING数据库中运行的结果导入Cytoscape 3.7.2中，对各靶点之间关系进行处理，依据degree值筛选出排名前20的靶点，绘制各靶点间相互作用关系图，图中圆圈大小表示靶点作用强度，圆圈越大，表明作用越强(见图3)。将红花、红花活性成分和红花与疾病共同作用靶点导入Cytoscape 3.7.2，构建“红花-活性成分-脑缺血共同靶点”网络图(见图4)。

图2 红花潜在治疗缺血性脑卒中作用靶点PPI网络图Fig.2 PPI network of potential therapeutic targets of safflower for ischemic stroke

图3 排名前20靶点间相互作用关系Fig.3 Interaction relationships among the top 20 targets

图4 “红花-活性成分-脑缺血共同靶点”网络图Fig.4 Network diagram of “safflower-active ingredient-cerebral ischemia common target”注：绿色节点表示红花活性成分；黄色节点表示红花与疾病共同作用靶点。Note:Green nodes represent active components of safflower;Yellow nodes represent common targets of safflower and disease.

3.4 GO功能及KEGG通路富集分析

采用DAVID 6.8数据库和R语言，将74个潜在靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。通过GO富集分析，共得226个条目，其中BP条目170个，MF条目28个，CC条目28个；根据Count值由大到小的顺序，分别选取前6个分析条目，BP中排名靠前的三个过程分别为RNA聚合酶II启动子转录的正调控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、炎症反应(inflammatory response)和基因表达的正调控(positive regulation of gene expression)，说明红花治疗缺血性脑卒中疾病的靶点主要与炎症反应等密切相关(见图5)。通过KEGG富集分析，共得92条信号通路，根据P-adjust和Count值对红花治疗缺血性脑卒中疾病的代谢通路进行分析，发现主要涉及AGE-RAGE、PI3K-Akt、TNF、HIF-1、IL-17信号通路(见图6)。

图5 GO功能富集分析图Fig.5 GO functional enrichment analysis diagram注：图中蓝色、黄色和绿色分别表示MF、BP和CC过程。Note:Blue,yellow and green represent MF,BP and CC processes respectively.

图6 KEGG通路富集分析气泡图(排名前20)Fig.6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis (top 20)注：图中气泡大小与颜色表示代谢通路富集程度，气泡越大，颜色越深表明富集程度越高。Note:The bubble size and color in the figure indicate the enrichment degree of metabolic pathway.The larger the bubble,the deeper the color,and the higher the enrichment degree.

3.5 分子对接验证

一般认为配体与受体结合，结合能越低，其构象越稳定，结合能≤-4.25 kcal/mol提示有一定结合活性，≤-5.0 kcal/mol说明有较好结合活性，≤-7.0 kcal/mol表示有较强结合活性[13]。通过AutoDock Vina进行分子对接，对接结果如表3，利用Discovery Studio Visualize将红花5种主要活性成分与关键靶点对接，将结合活性强的结果进行可视化处理(见图7)。

图7 红花关键活性成分与靶蛋白对接可视化图Fig.7 Visualization of the docking of key active components of safflower with target protein

4 讨论与结论

缺血性脑卒中会造成一系列不利影响，包括氧化应激、炎症反应、神经细胞凋亡和认知障碍等[1]。中医认为中风的主要病机在于阴阳失调，气血逆乱，治疗原则多以祛风通络、活血化瘀为主[14]。而红花是我国传统中药，属活血化瘀类，多见于活血化瘀类的复方中[15]。近年来在脑血管疾病中应用广泛，但其作用机制仍不明确，因此本文首次采用网络药理学和分子对接技术对红花治疗缺血性脑卒中机制进行探讨。

通过网络药理学发现，红花活性成分中槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、豆甾醇(stigmasterol)、木犀草素(luteolin)和羟基红花黄色素A(HSYA)作用靶点居多，是红花的主要活性成分。其中槲皮素[16]、山奈酚[17]、豆甾醇[18]、木犀草素[19]、羟基红花黄色素A[20]均具有抗炎抗氧化的作用，有作为炎症反应和氧化应激辅助治疗的潜力，山奈酚[17]和羟基红花黄色素A[20]还具有抑制细胞凋亡，改善微循环，矫正受损代谢通路的作用。因此推测这些成分可能是红花治疗缺血性脑卒中的关键。

将靶点间相互作用关系进行分析，通过degree值筛选发现TNF、VEGFA、IL6、CXCL8、ICAM1和CCL2靶点与红花活性成分作用关系强，是红花治疗缺血性脑卒中的关键靶点。研究发现肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)对细胞间黏附分子1(ICAM1)的表达具有调节作用，可引发血管炎性，并诱导炎性细胞从血管内转移至神经组织[21]，白介素-6(IL-6)[22]、CXCL8[23]、趋化因子配体2(Chemokine ligand 2，CCL2)[24]在缺血性脑卒中后炎症发生、发展过程中起着重要作用，而血管内皮生长因子A(VEGFA)[25]主要参与缺血性脑卒中后血管新生过程。通过GO和KEGG富集分析发现，AGE-RAGE、PI3K-Akt、TNF、HIF-1、IL-17信号通路是红花治疗缺血性脑卒中的主要通路。PI3K-Akt是细胞内重要存活和抗凋亡的信号转导通路[26]，AGE-RAGE信号通路可促进炎症因子的表达和释放，诱导细胞凋亡和促进血管新生[27]，HIF-1信号通路在急性脑缺血时可被激活，介导血管内皮生长因子VEGF的表达[28]，表明血管内皮生长因子在AGE-RAGE和HIF-1信号通路富集，且课题组前期研究表明HSYA通过刺激VEGF信号传导可治疗缺血性脑卒中[29]，这与网络药理学预测结果相一致。因此，红花治疗缺血性脑卒中是通过多成分、多靶点、多通路发挥抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡和促进血管新生等作用。

表3 红花关键活性成分与靶蛋白对接结果

通过分子对接技术进一步揭示红花治疗缺血性脑卒中疾病的作用机制，结果显示关键靶点与红花活性成分对接效果好，其中TNF与红花5种主要活性成分的结合能均≤-7.0 kcal/mol，表明有较强结合活性，IL6与槲皮素、山奈酚、木犀草素也有较强结合活性，而CXCL8和VEGFA与槲皮素、山奈酚、木犀草素结合能均≤-5.0 kcal/mol，有较好结合活性。因此推测红花主要活性成分与关键靶点结合可能是红花发挥治疗缺血性脑卒中的关键。

综上所述，本研究从整体角度阐述红花抗缺血性脑卒中的复杂关系，通过网络药理学的方法对红花治疗缺血性脑卒中机制进行分析，并运用分子对接技术对关键靶点进行验证。研究发现红花主要通过槲皮素、山奈酚和木犀草素等活性成分，作用于TNF、VEGFA、IL6、CXCL8等关键靶点，调节炎症反应、氧化应激、细胞凋亡和血管新生等作用，进而调控AGE-RAGE、TNF和IL-17等信号通路治疗缺血性脑卒中。研究结果为红花治疗缺血性脑卒中作用机制提供理论指导，也为缺血性脑卒中的药物研发提供参考。