毒死蜱降解菌的驯化筛选及高活性毒死蜱降解菌群的构建

孙孝文 刘诚 王慧敏

摘要 [目的]通过对3种活性污泥的长期驯化、微生物多样性分析及优势菌筛选与复配，构建一种对毒死蜱具有高降解活性的菌群。 [方法]以农药公司的3种不同废水处理工序的污泥为材料，利用毒死蜱长期胁迫驯化以获得高效降解毒死蜱的活性污泥;随后，在驯化后的3种活性污泥中筛选优势菌株，并以筛选的菌株构建复合菌群用于毒死蜱的降解。[结果]以毒死蜱为碳源，在驯化后的活性污泥中筛选到3株具有毒死蜱降解活性的菌株（Paracoccus MLCa-1、Klebsiella MLCp-2、Serratia MLCs-1），并对3种菌株进行复配，构建了复合菌群MLCF7。复合菌群MLCF7对100 mg/L毒死蜱降解率达82.84%。 [结论]复合菌群对毒死蜱具有高降解活性，表明其在农药污染生物修复中具有应用潜力。

关键词 毒死蜱;活性污泥;胁迫驯化;复合菌群;生物降解

中图分类号 X-172  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）13-0064-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.017

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Domestication and Screening of Chlorpyrifos degrading Bacteria and Construction of Composited Flora with High Chlorpyrifos degrading Capacity

SUN Xiao wen1，2，LIU Cheng2，WANG Hui min1

（1. Hubei Key Laboratory of Environmental and Health Effects of Persistent Toxic Substances， Institute of Environment and Health， Jianghan University， Wuhan，Hubei 430056;2. School of Life Sciences， Hubei University，Wuhan，Hubei 430062）

Abstract [Objective] Based on three activated sludges， through long term domestication， analysis of microbial diversity， and dominant bacteria screening and composition to construct a composited flora with high chlorpyrifos degrading capacity. [Method]Using sludge from 3 different wastewater treatment processes of pesticide companies as materials，the chlorpyrifos long term stress domestication was used to obtain activated sludge that efficiently degrades chlorpyrifos;subsequently， the dominant strains were screened from the three domesticated activated sludges， and the screened strains were used to construct a complex flora for the degradation of chlorpyrifos.[Result] Using chlorpyrifos as a carbon source， three dominant bacterial strains （Paracoccus MLCa 1， Klebsiella MLCp 2， and Serratia MLCs 1） were screened from these domesticated activated sludges when chlorpyrifos as the carbon source. A chlorpyrifos degrading flora was constructed by composition of these three dominant bacterial strains. The degradation capacity of the composited flora MLCF7 was reached 82.84% towards 100 mg/L chlorpyrifos. [Conclusion] The easily constructed composited flora MLCF7 has high degradation activities to chlorpyrifos， indicating it has the application potential for bioremediation of pesticide contamination.

Key words Chlorpyrifos;Activated sludge;Stress domestication;Composited flora;Biodegradation

毒死蜱是一種有机磷广谱杀虫剂，广泛应用于经济作物的病虫害防治[1-2]。作为一种乙酰胆碱酯酶（AChE）的抑制剂，毒死蜱可以结合AChE并使其失去分解乙酰胆碱的能力，导致大量乙酰胆碱积累，从而使中枢神经系统功能丧失，最终导致昆虫和哺乳动物死亡[3-4]。毒死蜱在农业上的大量持续使用，导致其在土壤和水中过量累积，从而对环境造成了严重的污染[1，5]。目前，已报道多种处理毒死蜱污染的方法，相较于传统的物理化学方法（紫外光解、fenton 氧化法、臭氧氧化法和多相光催化降解等[6-9]），微生物修复法具有高效、廉价、无二次污染等特点，被认为是安全有效的毒死蜱环境污染修复方法[10]。现已发现了一些来源于毒死蜱污染的土壤或者水体的毒死蜱降解菌株，包括Enterobacter、Pseudomonas、Serratia、Klebsiella、Bacillus、Paracoccus、Sphingopyxis、Ochrobactrum、Shewanella和Tistrella等[11-17]。相比单一微生物，复合菌群由于包含更健全的毒死蜱降解代谢基因，可有效避免降解途径中中间产物积累且对环境具有更强的适应性，更适合毒死蜱环境污染的修复。Vidya等[18]报道了来源于农药污染的土壤菌群（包含P.aeruginosa、B.cereus、Klebsiella sp.、S.marscecens）可以在30 d完全降解50 mg/L。Barathidasan等[19]报道了一种由Cellulomonas fimi 和Phanerochaete chrysosporium组成的菌群可以完全矿化毒死蜱，且其效果强于单种菌株。因此，开发新的毒死蜱降解菌群，将对毒死蜱农药污染修复有着积极意义。该研究使用来源于农药公司废水处理工序的3种污泥，利用毒死蜱长期胁迫驯化以获得高效降解毒死蜱的活性污泥;随后，在驯化后的3种活性污泥中筛选优势菌株，并以筛选的菌株构建了复合菌群用于毒死蜱的降解。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 活性污泥。3种活性污泥分别采集于湖北省农药公司中农药制备污水处理的不同工序。活性污泥MLCa采集于好氧池I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V（1∶1∶1∶1∶1比例混合）;活性污泥MLCp采集于推流曝气反应池;活性污泥MLCs采集于SBR反应器。

1.1.2 主要试剂。毒死蜱标准品（纯度≥99.0%）、3，5，6-三氯-2-吡啶醇（TCP）（纯度≥99.0%）购于Aladdin（中国，上海）。色谱级乙腈、二氯甲烷（纯度≥99.8%）购于MREDA（中国，北京）。

1.1.3 培养基。LB培养基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、NaCl 10.0 g，pH 7.0～7.2。MSM培养基：Na2HPO4 5.8 g、KH2PO4 3.0 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.25 g，pH 7.0～7.2。驯化补料培养基：葡萄糖10.0 g、（NH4）2SO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、酵母粉0.4 g，pH 7.0～7.2。

1.2 毒死蜱胁迫下活性污泥的驯化

将新鲜采集的3种活性污泥分别按30%的沉降比接种到含有90 mL无菌水的500 mL锥形瓶中，并补加50 mL灭菌的驯化补料培养基，使锥形瓶中液体的总体积为200 mL。28 ℃、150 r/min条件下进行驯化7 d后，静置过夜，倒出50 mL驯化体系上清，补加50 mL 新鲜的驯化补料培养基，并添加5 mg毒死蜱胁迫进行下一轮驯化。此后，后一轮驯化体系比前一轮毒死蜱添加量递增5 mg。循环驯化20次后，维持每轮100 mg毒死蜱添加量不变，继续驯化4次，结束驯化。

1.3 活性污泥微生物多样性检测

1.3.1 活性污泥取样。分别取3种活性污泥不同驯化时期（初始样品，第10轮驯化样品和最终驯化样品）的活性污泥样品各5 mL，8 000 r/min离心10 min去上清，活性污泥沉淀送至派森诺生物科技股份有限公司（中国，上海）进行微生物多样性分析。每个样品取3组平行样。

1.3.2

活性污泥微生物多样性检测及分析。微生物多样性测序平台为Illumina MiSeq。使用QIIME v1.8.0[20]对获得的高通量测序数据剔除不可靠的序列。对得到的序列进行合并，按97%的序列相似度对操作分类单元（OUT）进行划分;选取每个OTU中最丰富的序列作为OTU的代表序列。然后利用每个OUT的代表序列进行分类状态识别和系统发育分析。使用Chao1和Shannon指数考察微生物群落的Alpha多样性。使用R软件，对丰度前50位的属进行聚类分析并绘制热图。使用Metastats[21]分析样品之间在属水平上丰度的差异（P值<0.05具有统计学差异）。采用基于加权UniFrac距离的主坐标分析方法（PCoA）对群落相似性进行多维分析[22]。

1.4 毒死蜱检测

1.4.1 HPLC法毒死蜱浓度标准曲线绘制。色谱级乙腈配制0、50、100、150、200和250 mg/L的毒死蜱溶液，使用高效液相色谱仪LC-20A（SHIMADZU，日本）测定毒死蜱的浓度。色谱柱为Hypersil ODS-C18 反向色谱柱（4.6 mm×150 mm×5 μm）。流动相为乙腈∶水=70∶30，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，进样20 μL。检测波长290 nm，毒死蜱的保留时间为7.8 min，峰面积和毒死蜱浓度呈正相关，回归方程为峰面積= 9 951×毒死蜱浓度-22 414（R2=0.998）。

1.4.2 样品中毒死蜱含量的检测。取含毒死蜱溶液5.0 mL，加入2 倍体积的二氯甲烷萃取2次，回收下层有机相溶液，经无水Na2SO4 脱水后，在烘箱中吹干，并重溶于5.0 mL的乙腈中。预试验显示，萃取的回收率达90%。使用上述液相条件检测，并根据毒死蜱标准曲线计算样品中毒死蜱浓度。

1.5 毒死蜱降解菌的筛选与鉴定

1.5.1 毒死蜱降解菌的初筛。 将驯化后的活性污泥在初筛培养基I（MSM培养基添加100 mg/L毒死蜱）上进行划线分离;挑取生长良好的单菌落过夜活化，然后再在初筛培养基Ⅱ（MSM培养基添加200 mg/L毒死蜱）上进行划线分离;再将生长良好的单菌落过夜活化，最后在初筛培养基Ⅲ（MSM培养基添加500 mg/L毒死蜱）上进行划线分离，最终得到能够以500 mg/L毒死蜱为碳源生长的菌株。

1.5.2 毒死蜱降解菌的复筛。将上述分离的菌株过夜活化，按1%接种量接种于含100 mg/L 毒死蜱的MSM 液体培养基中，28 ℃、150 r/min培养7 d，8 000 r/min离心10 min检测上清液残留毒死蜱浓度，并计算毒死蜱的降解率：

降解率=（1-Ct/C0）×100%，

式中，Ct为农药残留浓度，C0为农药初始浓度。

1.5.3 毒死蜱降解菌的鉴定。挑取毒死蜱降解菌的单菌落，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），PCR扩增16S rRNA基因序列。PCR 产物回收后与载体pClone007 Blunt Vector 连接，转化感受态细胞E.coli DH5α后送至武汉擎科生物技术公司进行测序。将测序得到的结果在EzTaxon server 2.1 数据库[23]中进行比对后，采用CLUSTAL W对16S rRNA 基因序列进行多序列比对，并利用MEGA 6.0 软件[24]neighbor-joining method构建系统发育树分析，完成菌株鉴定。

1.6 复合菌群的构建及其降解毒死蜱的效率测定

1.6.1 复合菌群的构建。复合菌群由3 株经过交叉平板划线培养后没有拮抗活性的毒死蜱降解菌株组成。将过夜活化的3 株单菌（MLCa-1、MLCp-2 和MLCs-1），按照1∶1∶1 的体积比比例混合，并按1%的接种量将混合菌液接种到新鲜的LB 培养基中。28 ℃、150 r/min培养24 h，即得到复合菌群（MLCF7）。

1.6.2 复合菌群降解毒死蜱的效率测定。将OD600 nm=1.0 的MLCF7按2%的接种量接种到含有100 mg/L毒死蜱MSM 培养基中，28 ℃、150 r/min培养7 d。采用上述HPLC法检测毒死蜱的降解效率。

2 结果与分析

2.1 驯化后的活性污泥对毒死蜱的降解效果

3种来源于农药公司污水处理系统不同处理工序的活性污泥，在毒死蜱胁迫下，经过6个月的驯化后，回收了降解活性稳定的活性污泥。驯化后的活性污泥，以1%的添加量添加至含100 mg/L毒死蜱的MSM培养基中，在28 ℃、150 r/min的条件下，培养5 d，检测毒死蜱降解效率。由图1可见，随着培养时间的增加，3种活性污泥对毒死蜱的降解效率也不断增强。3种活性污泥对毒死蜱的第5天降解效率排序为活性污泥MLCp（100.00%）> 活性污泥MLCs（87.59%）> 活性污泥MLCa（82.34%）。3种驯化后的活性污泥对毒死蜱的降解率均达到了80%以上，说明经过毒死蜱的长期胁迫，活性污泥被成功驯化。

2.2 3种活性污泥在不同驯化时期的微生物多样性分析

2.2.1 样本微生物群落的Alpha多样性。对3種活性污泥在不同驯化时期进行了微生物多样性分析。样品包含初始样品（MLCa-0、MLCp-0、MLCs-0）、第10轮驯化样品（MLCa-2、MLCp-2、MLCs-2）和最终驯化样品（MLCa-4、MLCp-4、MLCs-4）。每个样本重复3次，使用A、B和C区别。

使用Chao1和Shannon指数评价样本微生物群落的Alpha多样性。Chao1指数值越大，表明群落的丰富度越高。Shannon指数值越高，表明群落的多样性越高。由表1可知，3种活性污泥在毒死蜱的长期胁迫下的驯化过程中，微生物群落丰富度和多样性呈现了不同的变化趋势。来源于好氧池的活性污泥MLCa在驯化过程中微生物群落丰富度和多样性均不断下降;来源于推流曝气反应池的活性污泥MLCp在驯化过程中微生物群落丰富度不断下降，多样性先上升后下降;来源于SBR反应器的活性污泥MLCs在驯化过程中微生物群落丰富度和多样性均不断上升。这可能与3种活性污泥原始微生物菌群组成差异有关。

2.2.2 基于UniFrac距离的PCoA主坐标分析。   由图2可知，每个点代表一个样本，不同颜色的点属于不同样本（组），两点之间的距离越近，表明2个样本之间的微生物群落结构相似度越高，差异越小。坐标轴括号中的百分比代表了对应的主坐标所能解释的原始数据中差异的比例。结果表明3种活性污泥在驯化的过程中，微生物群落结构都发生了明显的变化。菌群MLCp和MLCs驯化后微生物群落结构较为相近，与MLCa驯化后微生物群落结构差异较大。

2.2.3

结合聚类分析的群落组成热图。使用R 软件，对样本中丰度前50 位的属进行聚类分析并绘制热图。由图3可知，驯化结束后，活性污泥MLCa 中主要优势菌群有Paracoccus sp.、Enterobacter sp.和Methylobacillus sp.等;活性污泥MLCp 中主要优势菌群有Klebsiella sp.、Pseudoxanthomonas sp.和Achromobacter sp.等;活性污泥MLCs 中主要优势菌群有Serratia sp.、Bacillus sp.和Pseudomonas sp.等。

2.3 毒死蜱降解菌的筛选及鉴定

2.3.1 毒死蜱降解菌的筛选。将3种驯化后的活性污泥在含毒死蜱的MSM固体培养基中经过多次划线分离筛选，共得到7株可以以500 mg/L毒死蜱为碳源生长的菌株，分别为来源于活性污泥MLCa的MLCa-1和MLCa-2，来源于活性污泥MLCp的MLCp-1、MLCp-2和MLCp-3以及来源于活性污泥MLCs的MLCs-1和MLCs-2。所有毒死蜱降解菌株经过过夜活化后，按2%的接种量接种于含有100 mg/L 毒死蜱的MSM 培养基中，28 ℃、150 r/min培养7 d后，测定了菌株对毒死蜱的降解率。由图4可知，所有毒死蜱降解菌株对毒死蜱均有降解作用，其中，降解率前三的菌株为MLCa-1（降解率为53.71%）、MLCp-2（降解率为51.85%）和MLCs-1（降解率为65.37%）。

2.3.2 毒死蜱降解菌的鉴定。筛选的毒死蜱降解菌株的16S rRNA基因，经过CLUSTAL W多序列比对，MEGA 6.0构建系统发育树对菌株进行鉴定。由图5可知，MLCa-1与Paracoccus bengalensis JJJT的序列相似性为99.40%，MLCp-2与Klebsiella singaporensis LX3T的序列相似性为99.37%，MLCs-1与Serratia nematodiphila DSM 21420T的序列相似性为99.58%。因此将MLCa-1鉴定为Paracoccus sp.，MLCp-2鉴定为Klebsiella sp.，MLCs-1鉴定为Serratia sp.。

2.4 复合菌群MLCF7的构建及其对毒死蜱的降解

2.4.1 MLCF7降解毒死蜱的生长曲线和降解曲线测定。复合菌群MLCF7按1%的接种量接种于含100 mg/L毒死蜱的MSM培养基中，150 r/min培养7 d，监测毒死蜱的降解率。由图6可知，在7 d的降解过程中，降解体系的菌液OD600 nm不断上升，第5天后达到稳定期。相应地，在7 d的降解过程中，降解体系降解曲线也呈现不断的上升趋势。这表明复合菌群MLCF7可以降解毒死蜱，并利用毒死蜱为碳源生长。在第7天时，复合菌群MLCF7对毒死蜱的降解率达82.84%，由图4可知，3株单菌对毒死蜱的降解率都在50%～60%。复合菌群对毒死蜱的降解显著性高于3株单菌对毒死蜱的降解率。结果表明，3株单菌存在协同作用，提高了对毒死蜱的降解能力。

2.4.2 复合菌群MLCF7降解毒死蜱中间代谢产物研究。使用HPLC法检测第1天、第3天、第7天复合菌群MLCF7降解毒死蜱体系代谢产物，由图7可知，随着降解时间增长，毒死蜱浓度不断下降，中间产物TCP的浓度先上升后下降，直至消失。因此，复合菌群MLCF7 首先将毒死蜱降解成TCP，再进一步地TCP 被降解成其他的小分子物质。

3 结论与讨论

对3种来源于农药公司废水处理系统的污泥进行毒死蜱长期胁迫下的驯化，得到了3种对100 mg/L毒死蜱降解率达80%以上的活性污泥。对3种活性污泥驯化的过程进行微生物多样性分析，发现毒死蜱胁迫下3种活性污泥的菌群发生了明显的变化。其中，副球菌属、克雷伯氏菌属和沙雷式菌属等菌属在驯化的过程中被富集。通过以毒死蜱为碳源，在驯化后的活性污泥种筛选了3株毒死蜱降解细菌Paracoccus MLCa-1、Klebsiella MLCp-2和Serratia MLCs-1。以3种毒死蜱降解细菌构建了复合菌群MLCF7，对100 mg/L毒死蜱降解率达82.84%。

3种毒死蜱降解菌对毒死蜱的降解活性较低，但复合后降解活性明显增加，这种协同机制需进一步研究。复合菌群MLCF7降解毒死蜱会形成中间产物TCP，然而TCP如何继续被降解，也需进一步研究。复合菌群MLCF7构建简单，易循环构建使用，可避免活性污泥降解易退化的问题，在农药污染生物修复中具有应用潜力。

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