广西猪流行性腹泻病毒感染病例的确诊与`病毒S基因变异分析

杨春杰，秦毅斌，陈樱，韦祖樟，黄伟坚，赵武，欧阳康*

(1. 广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2. 广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，广西 南宁 530005)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病，临床上该病以水样腹泻、脱水以及呕吐为主要特征[1]。1971年，PED在英国被首次报道，随后波及世界上多个国家和地区，Debouck和Pensaert首次分离得到PEDV毒株并命名为CV777。2010年，PEDV的变异毒株在我国出现，并迅速在猪群内流行，造成了大规模的PED暴发[2-3]。2013年美洲首次暴发PED，随后蔓延至加拿大、墨西哥等北美国家，造成仔猪死亡超过700万头[4-5]。2014年初，韩国、日本等亚洲国家与中国台湾地区相继暴发严重的PED疫情。截至目前，PEDV已经席卷亚洲、欧洲、美洲的大部分国家与地区[6-7]，给世界生猪养殖业造成巨大的损失。

PEDV是冠状病毒科、α冠状病毒属的成员，为单股正链RNA病毒，呈球形，直径约95～190 nm，病毒基因组全长约为28 kb[8-9]。PEDV的结构蛋白有纤突(S)蛋白、小膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白，S蛋白在介导病毒入侵和诱导中和抗体的过程中发挥重要作用[10]，当病毒进入机体后，宿主细胞可以将S蛋白裂解为S1和S2两个亚基，其中S1亚基有助于识别上皮细胞受体，S2亚基有助于病毒与上皮细胞胞膜的融合[11-12]。一些研究表明，S基因对PEDV的生物学特性有较大的的影响，该基因与PEDV毒株的遗传进化、毒力改变等有着密切的关系[13-15]。

本研究通过对广西某规模化猪场腹泻病例进行临床诊断，并对感染猪群的PEDV毒株(命名为：CH/GXYL/2018)S基因进行序列测定与分析，为分析广西地区PEDV遗传变异情况，以及科学有效地防控PED提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒，购自上海百赛生物深圳分公司；AMV反转录试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；GreenTaqMix、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DNA Marker购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 发病情况与临床样品采集

病料来自广西玉林市某规模化养猪场。该猪场生产母猪存栏规模约1 000头，2018年10月之前猪场从未使用过腹泻疫苗，猪场内也未出现过腹泻疫情。2018年10月1日与2018年11月1日，对母猪群两次普免猪流行性腹泻病毒(AJ1102疫苗株)与猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)二联弱毒活疫苗。11月15日，哺乳舍母猪和14～16日龄的仔猪同时开始出现腹泻、呕吐等症状，至当月18日左右腹泻疫情逐渐加重，截止到12月11日，哺乳仔猪发病率约为50%，不同栋舍哺乳仔猪死亡率在5.5%～19.3%之间，保育猪和育肥猪未出现腹泻疫情。2018年12月16日，无菌采集腹泻仔猪的小肠送至本实验室进行病原检测。无菌条件下取腹泻仔猪小肠内容物，用PBS溶液进行稀释，并以5 000 r/min离心5 min，收集上清并于-80 ℃保存备用。

1.3 临床诊断与病理剖检

对发病猪群的临床症状进行观察；对发病死亡的哺乳仔猪进行病理解剖，重点观察仔猪的胃、小肠和肠系膜淋巴结的病变情况。

1.4 引物设计与合成

参考文献[16]的方法设计一对PEDV检测引物，目的片段长度为492 bp；参考文献[17]设计一对扩增PEDV S基因的引物，目的片段长度为4 430 bp(引物位置参考CHGD-01)，该引物扩增的目的基因片段包含PEDV S基因的全长序列(表1)。引物均由上海杰李生物技术有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 病毒RNA的提取及反转录

临床样品经12 000 r/min 4 ℃ 离心5 min后，按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒说明书抽提病毒总RNA并进行反转录，反转录体系为：5×Buffer 2.5 μL，dNTP mix 1 μL，M-MLV Reverse Transcriptase 0.25 μL，RNasin酶抑制剂0.25 μL，下游引物0.5 μL，RNA 8 μL。42 ℃ 反应1 h，cDNA产物于-80 ℃保存备用。

1.6 临床样品的PCR检测

PEDV PCR检测的反应体系为：GreenTaqMix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，cDNA模板 3 μL，加ddH2O补至25 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共34个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。反应结束后，扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。同时，参考王睿敏等[18]的方法，对引起猪腹泻的常见病原TGEV、猪轮状病毒(PRoV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)进行RT-PCR检测。

1.7 S基因PCR扩增与测序

以病毒的cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系为：PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，cDNA 3 μL，加ddH2O至25 μL。扩增条件为：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s、53 ℃ 15 s、72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。反应结束后，扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将得到的目的片段进行纯化，并将纯化后的产物送至上海杰李生物技术有限公司进行测序。

1.8 S基因生物信息学分析

应用DNAStar-SeqMan软件，将测序得到的S基因进行拼接，得到PEDV的S基因全长序列。应用DNAStar-MegAlign软件，将PEDV S基因序列与GenBank上发表的32条PEDV毒株S基因参考序列(表2)，进行比对分析，并利用Mega 5.0软件，采用Neighbor-joining方法构建系统遗传发育进化树。应用ProtScale软件分析S蛋白疏水性，应用Protean软件分析S蛋白抗原指数。

表2 PEDV参考毒株信息

2 结果

2.1 临床观察与病理剖检

经临床观察发现，腹泻仔猪表现为精神沉郁，体型消瘦，体毛凌乱且皮肤多被腹泻物污染，仔猪多在2～8日龄出现不同程度的腹泻，新生仔猪最早可在出生当天出现腹泻，7日龄内的仔猪在发病后3～4 d多因严重脱水而死亡。腹泻仔猪多伴随呕吐症状，粪便呈灰黄色或灰白色。患病母猪表现为食欲下降、精神不振，但是腹泻症状较轻。腹泻疫情只出现在产房，耐过后的仔猪死亡率较低。

剖检腹泻死亡的哺乳仔猪，在其胃内可见大量的凝乳块(图1)，仔猪主要病变为小肠肿胀扩张(图2)，肠壁变薄并且缺乏弹性，肠系膜充血，在肠道内可见大量的黄色液体，肠系膜淋巴结肿大，小肠黏膜有出血点。

图1 哺乳仔猪胃内充满凝乳块

图2 小肠肿胀扩张充满黄色液体

2.2 临床样品RT-PCR检测

对临床腹泻样品进行PEDV RT-PCR扩增，将反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果扩增出492 bp的条带，与预期目的条带大小一致(图3)，说明临床样品存在PEDV的感染，同时对TGEV、PRoV和PDCoV进行检测，结果均为阴性。

M. DL 2000 Marker；1. 阴性对照；2. 阳性样品

2.3 S基因扩增

以病毒的cDNA为模板，进行PEDV的S基因PCR扩增，得到与预期大小一致的目的条带(图4)，将扩增的目的片段进行纯化，并将纯化后的产物进行测序。测序序列经与NCBI上公布的PEDV参考株序列比对，确认得到了S基因的全长序列,并将其来源毒株命名为CH/GXYL/2018毒株。

M. DL 5000 Marker；1. 阴性对照；2. S基因扩增

2.4 综合诊断

通过对发病猪群的流行病学调查、临床症状和病理变化的观察，结合实验室分子诊断技术等的综合分析，初步诊断此次疫情是由PEDV感染引起。

2.5 S基因序列分析

2.5.1 S基因同源性与遗传进化分析

应用DNAStar-SeqMan软件对CH/GXYL/2018毒株的S基因进行比对和拼接，结果显示，CH/GXYL/2018毒株的S基因全长4 158 nt，编码1 385 aa。应用MegAlign软件，将CH/GXYL/2018毒株的S基因核苷酸序列，与GenBank上发表的32株PEDV参考毒株的S基因核苷酸序列进行同源性分析。结果表明，CH/GXYL/2018与国内外参考毒株S基因比对，核苷酸同源性为92.8%～99.5%，氨基酸同源性为91.8%～99.2%(表3)。CH/GXYL/2018与中国疫苗株AJ1102的S基因核苷酸同源性为98.9%，与中国广东GD-A株S基因核苷酸同源性高达99.5%，与广西地区分离株CH-GX-2015-750A的S基因核苷酸同源性为97.4%，而与ZJU-G1-2013毒株的核苷酸同源性仅为92.8%。

表3 S基因同源性比对结果

用CH/GXYL/2018与GenBank上发表的国内外PEDV参考毒株，构建S基因核苷酸遗传发育进化树，结果如图5显示。PEDV毒株形成两个较明显的分支，分为G1与G2型，广西毒株CH/GXYL/2018与国内PEDV疫苗株AJ1102在同一个分支上，与FL2013、GD-A毒株的遗传距离较近，与经典疫苗毒株CV777(vaccine)和Attenuated-DR13亲缘关系较远。遗传进化分析表明，CH/GXYL/2018属于G2-a变异毒株。

▲为本试验获得的S基因序列；●为疫苗株S基因序列

2.5.2 S基因突变位点分析

应用MegAlign软件，将CH/GXYL/2018毒株的S基因核苷酸序列与中国G2型疫苗参考株AJ1102进行比较，结果发现，CH/GXYL/2018毒株的S基因共有37个核苷酸发生了突变，共造成14个氨基酸变异。将广西地区CH/GXYL/2018毒株的S基因氨基酸与19株国内外PEDV参考毒株进行比较，结果显示，CH/GXYL/2018与中国G2型疫苗参考株AJ1102有多处相同的氨基酸突变位点，分别为369位氨基酸处(T→I)、492位氨基酸处(R→T)、501位氨基酸处(I→T)、1 212位氨基酸处(F→Y)、1 220位氨基酸处(S→G)、1 270位氨基酸处(P→S)。比对结果中没有发现S基因氨基酸的插入或缺失，S基因氨基酸主要突变位点为：216位氨基酸处(M→I)、768位氨基酸处(P→R)、1 242位氨基酸处(D→E)，在807、827、890、894、1 379、1 384位氨基酸处，CH/GXYL/2018的氨基酸突变与参考毒株均不相同(表4)。

表4 S基因氨基酸主要突变位点分析

2.5.3 S蛋白疏水性与抗原性分析

应用ProtScale软件，对CH/GXYL/2018的S蛋白的疏水性进行分析。结果发现，S蛋白在第1 336 aa位点的疏水性数值最大，为3.978；在第1 210 aa位点的疏水性数值最小，为-2.611。与参考毒株中的AJ1102相比，S蛋白第807位氨基酸从丝氨酸突变为异亮氨酸，第827位氨基酸从谷氨酰胺突变为组氨酸，而导致该区域的疏水性发生了较大的变化(图6)。

A. CH/GXYL/2018 S基因疏水性；B. AJ1102 S基因疏水性

应用Protean软件，根据Jameson-Wolf方法预测CH/GXYL/2018 S蛋白抗原指数，并与国内外发表的5株G2型PEDV参考毒株S蛋白抗原指数进行差异性分析。分析结果显示，由于氨基酸的突变，广西地区CH/GXYL/2018毒株的S蛋白抗原指数在800～813 aa区域发生了明显的改变，说明广西地区CH/GXYL/2018毒株在该区域的抗原性发生了较大变化(图7)，与参考毒株中的AJ1102相比，CH/GXYL/2018的抗原性在767～772 aa区域也出现了变化。

图7 S蛋白抗原指数预测分析结果

3 讨论

自PEDV被发现以来，该病毒给世界上很多国家和地区的生猪养殖业带来了巨大的冲击。截止目前，PED的流行范围进一步扩大，给猪群健康造成较大的威胁。本研究通过临床观察、病理解剖以及实验室RT-PCR检测，对广西玉林市某规模化猪场猪群腹泻进行了确诊，综合分析发现，本次疫情是由PEDV变异株感染哺乳母猪和哺乳仔猪所引起的。流行病学调查显示，虽然猪场曾对母猪群两次普免PEDV与TGEV二联弱毒活疫苗(PEDV疫苗株为AJ1102)，但是猪群依然出现了PEDV变异株感染的疫情，表明疫苗并没有对猪群提供完全保护。通过对本案例分析发现，猪群第2次普免二联弱毒活疫苗的时间为产前一周之内，母猪上产房后，PEDV抗体水平没有得到有效提升，仔猪不能得到有效保护，疫苗的免疫时机也可能是造成这次疫情出现的重要因素。2018年10月之前猪场没有腹泻发生，猪场环境中PEDV的含量很低，通过必要的消毒措施进行控制，加上合理的饲养管理，可以给猪群提供日常保护。通过腹泻疫苗对猪群的普免，能够很好地建立起猪群的免疫屏障，但是一旦部分猪群免疫水平低下，PEDV对猪群形成有效感染，发病猪群向环境中排放大量的病毒，猪的抗体难以抵抗大剂量强毒攻击时就会形成猪群发病[19]。另外调查发现，在猪群发病期间，当地有连续多天的阴雨天气，昼夜温差较大，环境突变也可能是PED暴发的影响因素。疫病发生后，猪场并没有果断采取消灭传染源、切断病毒在单元间的传播途径等措施，从而导致了PEDV在场区的传播。

PEDV的S蛋白能够诱导机体产生中和抗体，在病毒粒子通过膜融合入侵到宿主细胞的过程中发挥关键作用，S基因的突变还能够引起PEDV的不断进化与病毒毒力的改变[20-21]。根据PEDV S基因N末端结构域的不同，可以将PEDV分为G1与G2型[22]。本研究在遗传进化分析中发现，CH/GXYL/2018与FL2013、GD-A有着较近的遗传距离，属于PEDV G2-a变异型毒株。氨基酸突变位点分析显示，CH/GXYL/2018与中国G2型疫苗参考株AJ1102也有多处相同的氨基酸突变位点，但是在807、827、890、894、1 379、1 384位氨基酸处，广西CH/GXYL/2018毒株的氨基酸突变与参考毒株均不相同，至于这些突变位点对病毒致病性的影响，尚有待于进一步深入研究。核苷酸同源性分析显示，CH/GXYL/2018与疫苗株CV777的核苷酸同源性仅为93.2%，在59～62位氨基酸处CH/GXYL/2018有氨基酸的连续插入，在159～160位氨基酸处存在氨基酸的缺失，与前人的研究结果相似[23-26]。CH/GXYL/2018与广东毒株GD-A的核苷酸同源性达到99.5%，并且多处氨基酸突变位点相一致。另外，本研究还对S蛋白的疏水性和抗原指数进行了预测分析，结果显示，CH/GXYL/2018的变化位点多集中在800～827位氨基酸处，这与氨基酸突变位点分析相一致，推测CH/GXYL/2018的S蛋白结构在此处发生了较大的变化。

随着PEDV在世界各国和地区之间流行范围的不断扩大，毒株出现了不同程度的变异，目前变异株疫苗在养猪生产中已得到了广泛的应用，但是由于该病毒变异进化较快[27]，免疫失败的案例依然时有发生。在对PED的防控中，及时开发并应用与PEDV流行毒株相一致的疫苗依然具有重要意义。由于PEDV感染后没有很好的治疗方法，实际生产中应以预防为主，建立完善的猪场生物安全体系尤为必要。猪流行性腹泻多发生在气温寒冷的冬春季节，因此，生产中应注意冬春季节仔猪的防寒保暖，加强对仔猪的饲养管理，提升猪群的抵抗力，从根源上杜绝PEDV对猪群的感染。