黑水虻(Hermetia illucens L.)幼虫脂肪抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外增殖

吴芷慧，刘元，胡文锋，曹永长*

(1. 中山大学生命科学学院，有害生物控制与资源利用国家重点实验室,广东 广州 510006;2. 华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；3. 广州无两生物科技有限公司，广东 广州 510640)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)属于套式病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Arterivirus)，是一种具有囊膜的单股正链RNA病毒，是猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)的病原。感染PRRSV的猪群会出现持续且严重的呼吸道疾病，体重和生长性能下降，母猪出现繁殖障碍[1]。PRRSV的感染具有免疫抑制、抗体依赖性增强、多毒株混合感染和继发感染等特征，畜群持续带毒，再加上PRRSV基因组和抗原的不断变异，传统PRRSV疫苗免疫效果不理想，难以控制和根除PRRSV在猪场的存在和流行。

目前对抗PRRS的另一条思路是寻找抗病毒药物[2]。PRRSV是囊膜病毒，入侵细胞需要经过膜融合的过程[3]，因此通过使用阻断膜融合的药物，可以阻止病毒入侵细胞。分子结构中同时具有亲水端和疏水端的一类分子，可以插入囊膜，影响囊膜曲度或造成囊膜瓦解，从而阻断病毒囊膜和细胞的膜融合。Thormar等[4]研究发现，饱和中链脂肪酸、不饱和长链脂肪酸及它们的单甘油酯可以插入病毒囊膜，导致囊膜病毒瓦解。Yuan等[5]研究表明，脂肽表面活性素(surfactin)可以插入猪流行性腹泻病毒(PEDV)囊膜，通过影响囊膜曲度，抑制囊膜与细胞膜的融合，自助口服脂肽可以更好地抵抗PEDV。动物试验证明，仔猪口服脂肽可以更好地抵抗PEDV的感染。张西奎[6]动物试验显示，给PRRSV阳性母猪饲喂月桂酸单甘油酯，可以提高繁育和生长性能。

黑水虻(black soldier fly,HermetiaillucensL.)幼虫脂肪中富含月桂酸(C12：0)，含量可超过30%，具有抗囊膜病毒的潜能[7-8]。动物试验亦已证明，黑水虻幼虫虫粉代替血浆蛋白粉和鱼粉用于保育猪饲养的可行性[9]。本研究将探究黑水虻幼虫脂肪的抗PRRSV能力及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 黑水虻幼虫脂肪的获取

黑水虻新鲜幼虫由华南农业大学食品学院胡文锋副教授提供。黑水虻新鲜幼虫清洗干净，干燥粉碎后，用连续相变萃取装置提油，毛油经去除固体杂质、脱胶、脱酸，得到精炼黑水虻幼虫脂肪[10]。常温密封避光保存；或置于-20 ℃冰箱，密封避光长期保存。

1.2 细胞和病毒

Marc-145细胞(非洲绿猴胚胎肾细胞)生长并维持在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)在Marc-145细胞上增殖培养，并保存于-80 ℃。

1.3 黑水虻幼虫脂肪的水解和乳化

用猪胰脂肪酶对黑水虻幼虫脂肪进行酶解消化。20 mg/mL猪胰脂肪酶与等体积黑水虻幼虫脂肪混合，37 ℃摇24 h。常温6 000 r/m离心5 min，分离油相，得到水解黑水虻幼虫脂肪。向水解黑水虻幼虫脂肪中加入3% Span-80，ddH2O中加入3% Tween-80，振荡摇匀。脂肪与水的体积比为1∶4，分散机搅拌5 min，得水解黑水虻幼虫脂肪乳化液。微波炉高火微波30 s灭菌。乳化液中水解黑水虻幼虫脂肪浓度记为200 mg/mL。

将黑水虻幼虫脂肪和水解黑水虻幼虫脂肪乳化液(BSFLh)送至中国广州分析测试中心，检测其脂肪酸组成。

1.4 月桂酸单甘油酯水溶液和乳化剂水溶液的制备

称取1 g月桂酸单甘油酯(GML)溶于4 mL无水乙醇，加入3% Span-80。配制含3% Tween-80的ddH2O，往水中4∶1加入月桂酸单甘油酯-无水乙醇溶液，搅拌5 min。月桂酸单甘油酯水溶液成品为澄清溶液。微波炉高火微波30 s灭菌，保存在37 ℃，用于细胞试验。

向ddH2O中加入3% Tween-80和0.6% Span-80，振荡摇匀，即得乳化剂水溶液。

1.5 细胞毒性检测

在96孔板中接种Marc-145细胞，待测药物(BSFLh、GML或乳化剂水溶液)用细胞维持液梯度稀释，每孔加100 μL，孵育24 h，吸出上清，用PBS缓冲液清洗3遍后，加入100 μL含10% CCK-8溶液的DMEM培养基，培养箱中孵育1 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.6 病毒增殖抑制

在12孔板中接种细胞悬液，放在培养箱(37 ℃、5% CO2)中培养至细胞完全汇合，弃上清，加入感染比(MOI)为1病毒液，37 ℃孵育1 h，弃上清，用适量PBS清洗3遍，加入培养基，在37 ℃继续培养至相应时间点。

PRRSV在Marc-145细胞上增殖的过程如图1A所示，分为4个阶段：感染前、吸附、侵入和复制阶段。在感染前，PRRSV放置于4 ℃，Marc-145细胞处于37 ℃培养箱；在吸附阶段，将PRRSV添加到Macr-145细胞上，4 ℃孵育30 min，PRRSV吸附在Macr-145细胞上但未侵入细胞；在侵入阶段，将添加了PRRSV的Marc-145细胞置于37 ℃孵育1 h，使得以PRRSV侵入细胞；在复制阶段，培养液上清中的游离PRRSV被清除，侵入Marc-145细胞的PRRSV开始增殖。

为了研究BSFLh在哪个阶段抑制PRRSV增殖，阶段抑制试验设计了8个BSFLh添加模式，如图1B所示。模式1全程不加BSFLh，为对照组，模式2全程加BSFLh，模式3在细胞感染前和吸附阶段加BSFLh，模式4在细胞感染前加BSFLh，模式5在病毒感染前和吸附阶段加BSFLh，模式6在吸附阶段加BSFLh，模式7在侵入阶段加BSFLh，模式8在复制阶段加BSFLh。

A. PRRSV在Marc-145细胞上增殖的过程区分为4个阶段；B. 阶段抑制试验8个加药模式，分别为模式1～模式8，加药开始和结束如双向箭头所标注

1.7 细胞RNA的提取和逆转录

收集了细胞的TRIZOL裂解液中加入100 μL氯仿，充分振荡，室温静置5 min后4 ℃ 12 000g离心15 min。吸取上层清液到新的1.5 mL RNase-free EP管中，加入等体积预冷的异丙醇，充分混匀后静置10 min，4 ℃ 12 000g离心10 min。弃上清，加入1 mL预冷的75%乙醇清洗RNA沉淀，4 ℃ 7 500g离心5 min。弃上清， RNA沉淀干燥至无色透明，加入适量DEPC水使沉淀溶解，即获得细胞总RNA。cDNA的合成按照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA remover说明书进行。

1.8 实时定量荧光PCR(RT-qPCR)

RT-qPCR按翊圣生物qPCR试剂盒Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)说明书进行操作。每一个样品设3个重复孔，在LightCycler 480 Ⅱ仪上进行反应。反应条件为：预变性95 ℃，5 min；变性95 ℃，10 s，退火58 ℃，20 s，延伸72 ℃，20 s，40个循环；溶解曲线：95 ℃，5 s，65 ℃，1 min，97 ℃，10 min，40 ℃，10 s。设置细胞GADPH作为内参基因，用相对定量法分析基因的mRNA水平。qPCR引物序列如表1所示。

表1 qPCR所用引物及其序列

2 结果与分析

2.1 水解黑水虻幼虫脂肪乳化液的理化性质

检测黑水虻幼虫脂肪经水解、乳化处理后理化性质是否有显著改变，测算脂肪酶水解前后黑水虻幼虫脂肪的酸值。未水解黑水虻幼虫脂肪的酸值为1.21 mg/g，水解后酸值为81.48 mg/g，说明黑水虻幼虫脂肪经水解后产生大量游离脂肪酸。

检测黑水虻幼虫脂肪水解、乳化前后脂肪酸组成的改变，结果见表2。水解、乳化操作对黑水虻脂肪中含量大于1%的脂肪酸变异小于3%，认为水解、乳化操作对黑水虻幼虫脂肪的肪酸组成无显著影响。该批黑水虻脂肪的脂肪酸组成月桂酸(C12：0)和油酸(C18：1)含量最高，均达到22%以上；其次为棕榈酸(C16：0)和亚油酸(C18：2)，含量在18%～20%之间。

表2 水解、乳化前后黑水虻幼虫脂肪中脂肪酸组含量 %

2.2 水解黑水虻幼虫脂肪乳化液抑制PRRSV的感染

要验证BSFLh是否具有抑制PRRSV感染的活性，首先需要验证BSFLh对Marc-145细胞是否具有细胞毒性。向Marc-145细胞中加入不同浓度(62.5、125、250、500、1 000、2 000 μg/mL)的BSFLh，对照组不加BSFLh，培养24 h，进行CCK8试验并绘制细胞活力曲线，结果如图2所示。BSFLh浓度的升高会导致Marc-145细胞活力的下降，当BSFLh浓度不高于500 μg/mL时，其细胞活力与对照组细胞活力(100%)相比没有显著差异。

BSFLh各试验组与对照组相比，***表示P≤0.001，****表示P≤0.000 1。下同

为了验证BSFLh抑制PRRSV感染的活性，在PRRSV感染Marc-145细胞全程加入BSFLh(加药模式2)，浓度分别为0 μg/mL、250 μg/mL和500 μg/mL，在3 h、6 h、12 h和24 h收取细胞样，并用实时定量PCR检测PRRSV N基因在RNA水平，单因素方差分析计算差异，结果如图3所示。含有BSFLh 250 μg/mL和500 μg/mL的试验组在所有时间点，RNA水平较对照组均显著降低，说明PRRSV的增殖被BSFLh抑制。

A.3 h；B.6 h；C.12 h；D.24 h

2.3 BSFLh抑制PRRSV增殖前期

通过分阶段加药试验探究BSFLh抑制PRRSV增殖的机制。BSFLh的浓度为500 μg/mL，收样时间分别为3 h和6 h，用荧光定量PCR检测PRRSV N基因的变化，结果如图4所示。模式3(在细胞前处理和吸附阶段加药)、模式5(在病毒前处理和吸附阶段加药)、模式6(在吸附阶段加药)这3个模式的RNA水平在3 h和6 h较对照组均显著下降；模式4(在细胞前处理阶段加药)和模式7(在侵入阶段加药)的RNA水平，在3 h时较对照组无显著差异，在6 h时显著低于对照组；模式8(在复制阶段加药)RNA水平在3 h和6 h较对照组均无显著差异。上述结果说明，BSFLh抑制PRRSV增殖作用是在抑制PRRSV增殖的前期，尤其是吸附阶段产生，在PRRSV增殖的后期无法抑制，当病毒已经进入细胞并开始复制，培养基中添加BSFLh无法对PRRSV的增殖起抑制作用。

A. 收样时间为处理3 h；B. 收样时间为处理6 h;加药模式2～模式8分别与加药模式1(对照组)进行比较，*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001，****表示P≤0.000 1

2.4 探究BSFLh的有效成分

为了排除乳化剂本身对试验造成的影响，比较了含有相同浓度乳化剂的BSFLh和乳化剂水溶液(emu)对PRRSV增殖的影响，用CCK8检测emu对Marc-145细胞的细胞毒性，结果如图5所示。与BSFLh相比，emu对Marc-145细胞的细胞活力无显著影响。

横坐标所标浓度表示BSFLh中水解黑水虻幼虫脂肪的浓度，相同横坐标，BSFLh和emu中乳化剂含量相同； **表示P≤0.01，****表示P≤0.000 1。下同

在PRRSV感染Marc-145细胞全程加入250 μg/mL BSFLh或含乳化剂的emu(加药模式2)后，3、6、12和24 h检测N基因RNA水平，比较含有等浓度乳化剂的BSFLh和emu对PRRSV增殖的影响，结果如图6所示。 含等浓度乳化剂(加药模式2)的emu组的N基因RNA水平在3 h与对照组相比无显著差异，在6 h、12 h和24 h显著降低；含与emu组相同浓度乳化剂的BSFLh组的RNA水平在所有时间点显著低于emu组，表明BSFLh组对PRRSV增殖的抑制效果较emu组更强。试验结果说明，水解黑水虻幼虫脂肪乳化液抑制PRRSV增殖的能力来自于水解黑水虻幼虫脂肪和乳化剂。

各组分别与对照组(NC)进行比较并通过单因素方差分析计算显著性，同时间点收样的BSFLh组和emu组通过双尾t检验计算显著性。ns表示P>0.05

月桂酸在黑水虻幼虫脂肪的脂肪酸组成中含量最高(表2)，黑水虻脂肪补充动物消化吸收过程中，主要以月桂酸单甘油酯和游离月桂酸的形式存在。为探究了月桂酸单甘油酯对PRRSV增殖的影响，以验证月桂酸单甘油酯是黑水虻幼虫脂肪抑制PRRSV增殖的原因。以验证月桂酸单甘油酯是黑水虻幼虫脂肪抑制PRRSV增殖的原因。向Marc-145细胞中分别加入浓度4、8、16、32和64 μg/mL的月桂酸单甘油酯后，培养24 h，进行CCK8试验并绘制细胞活力曲线，结果如图7所示。当培养液中月桂酸单甘油酯含量不超过16 μg/mL时，月桂酸单甘油酯对Marc-145细胞的细胞活力没有显著影响。

不同浓度GML试验组与NC组相比

PRRSV在Marc-145细胞上增殖的全程以加药模式2加入浓度分别为0(对照组)、16 μg/mL、8 μg/mL的月桂酸单甘油酯后，对3 h、6 h和12 h收取的细胞RNA样品，经实时定量PCR检测PRRSV N基因水平，并进行单因素方差分析，结果见图8。在3个时间点，含不同浓度月桂酸单甘油酯的试验组N基因水平与对照组相比均无显著下降，反而在6 h和12 h时出现了显著上升。说明该条件下的月桂酸单甘油酯无法抑制PRRSV的增殖。

A. GML作用PRRSV 3 h；B. GML作用PRRSV 6 h；C. GML作用PRRSV 12 h；与NC组相比，*P≤0.05，***P<0.001

3 讨论

PRRSV是一种具有囊膜的RNA病毒，可以感染各年龄段猪群。感染猪群会出现程度不一的呼吸道疾病并导致生长性能下降，母猪出现繁殖障碍。由于PRRSV的感染具有免疫抑制、抗体依赖性增强的特点，再加上变异毒株的不断出现，传统的PRRSV疫苗不足以防控PRRSV的传播。因此抗病毒药物的开发具有重要意义。

前人针对囊膜病毒的研究表明，人乳汁中的脂质在婴儿肠胃中经脂蛋白脂肪酶水解后，脂肪酸和其他产物对囊膜病毒具有显著抑制作用[4]。其中，长链不饱和脂肪酸和中链饱和脂肪酸，尤其是月桂酸(C12：0)和豆蔻酸(C14：0)，对囊膜病毒的抑制最为显著。癸酸单甘油酯和月桂酸单甘油酯对囊膜病毒抑制作用比游离癸酸(C10：0)和月桂酸更强，起效浓度仅为后者的1/10；而豆蔻酸单甘油酯抑制囊膜病毒的效果相对较弱。长链饱和脂肪酸和短链脂肪酸则几乎没有抗囊膜病毒作用。脂肪酸及其单甘油酯对囊膜病毒的抑制作用主要是通过插入病毒囊膜、破坏囊膜结构达成。往人乳汁或婴儿配方奶粉中添加中链脂肪酸或单甘油酯，可以提高它们的抗病毒活性[10]。

黑水虻是一种新兴资源昆虫。黑水虻幼虫干制后可以用于动物饲料的额外营养添加，一定程度上可以取代目前广泛使用的鱼粉和血浆蛋白粉[8]。月桂酸在黑水虻幼虫脂肪酸组成中含量最高，最高时可占总脂肪酸组成的约40%，其次是豆蔻酸、棕榈酸、油酸和亚油酸[6-7,11]。根据黑水虻幼虫脂肪的这种特性，推测黑水虻幼虫脂肪与母乳一样，其代谢产物在一定浓度下同样具有破坏病原膜结构、抑制病原体内增殖的作用，并在体外进行了水解黑水虻幼虫脂肪抑制PRRSV增殖的试验。

在研究BSFLh在体外对PRRSV的抑制作用中，发现在细胞安全浓度下，BSFLh对PRRSV具有显著抑制作用。分阶段加药抑制试验表明，BSFLh主要在PRRSV侵入细胞前起抑制作用，PRRSV侵入细胞后加药无法抑制病毒的增殖。这与前人研究中的描述(脂肪酸及其单甘油酯抗囊膜病毒主要是通过插入病毒囊膜破坏囊膜结构)是吻合的。因此推测，在PRRSV侵入细胞前，添加BSFLh可对暴露在细胞外的病毒粒子的囊膜造成破坏，抑制PRRSV与细胞的膜融合；在PRRSV侵入细胞后，细胞安全浓度下的BSFLh无法对细胞内的病毒造成影响，因此无法抑制PRRSV的增殖。

为了模拟油脂消化后的状态，试验中的黑水虻幼虫脂肪经过了水解和乳化。脂肪酶水解后的酸值检测表明，游离脂肪酸主要存在于油相中(数据未展示)，因此必须通过添加乳化剂对其进行水包油乳化，方能使其均匀分布于水相的细胞培养液或维持液。然而，乳化剂本身化学组成与结构令其同样具备插入并破坏膜结构并抑制囊膜病毒的能力，为了区分乳化剂和水解黑水虻幼虫脂肪的作用，本研究比较了乳化剂水溶液和BSFLh的抑制效果。结果和预测一致，乳化剂具备抑制PRRSV的作用，但含有相同浓度乳化剂的BSFLh对PRRSV的抑制效果显著更强，说明水解黑水虻幼虫脂肪本身对PRRSV增殖的抑制作用是确实存在的。

给PRRSV阳性母猪饲喂月桂酸单甘油酯3个月，母猪发情率大大提高，产仔数提高，死胎比例大大降低，断奶率提高8%，保育猪的生长速度和成活率都有提高[9]。在椰子油中，月桂酸约占总脂肪酸组成的45%～53%。在断奶仔猪的日粮中添加蒸馏椰子脂肪酸钠盐，减少了断奶仔猪肠道中致病菌的定植数，有利于肠道健康，改善了仔猪的生产性能[12-13]。但本研究在细胞安全浓度下，月桂酸单甘油酯没有抑制PRRSV在Marc-145细胞中的增殖，相反，还起到了促进作用。究其原因，月桂酸单甘油酯可能无法抑制PRRSV的增殖，抑制PRRSV增殖的是黑水虻幼虫脂肪中的其他成分。Issacs等[10]的研究发现，月桂酸单甘油酯抑制呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的效果较差，说明月桂酸单甘油酯不是对所有囊膜病毒都能起到良好抑制作用，其机制还需要进一步探讨。另外一个可能原因是，Marc-145细胞对月桂酸单甘油酯耐受较低，可能月桂酸单甘油酯对PRRSV起抑制效果需要更高的浓度。除此以外，也可能是因为本试验中月桂酸单甘油酯以无水乙醇作为溶剂，而无水乙醇影响了细胞或病毒的正常增殖。本研究中月桂酸单甘油酯在Marc-145细胞上的细胞安全浓度为16 μg/mL，而在Thormar等[4]的研究中，月桂酸单甘油酯抑制水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)和I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1，HSV-1)的有效浓度为250 μg/mL。

综上，水解黑水虻幼虫脂肪可抑制PRRSV在细胞上的增殖。在对PRRSV进行进一步增殖抑制试验后发现，抑制作用主要发生在病毒侵入细胞前。月桂酸单甘油酯可能不是水解黑水虻幼虫脂肪抑制病毒增殖的主要原因。