和田羊和小尾寒羊尾脂的显微和超微结构比较

翟少华，向微微，胡美荷，孙亚伟，蒙建菊，叶梦珺，候萌，阿丽雅，王金泉*，胡燕

(1. 新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2. 新疆维吾尔自治区科技人才开发中心，新疆 乌鲁木齐 830011)

新疆是我国重要的羊养殖和羊肉生产地区，其肉羊品种也以脂臀羊居多，阿勒泰大尾羊成年后尾脂可达体重的17%[1]。养殖业中，胴体中脂肪的沉积水平是影响肉质的关键因素，畜禽脂肪过度沉积会影响畜禽的生产效能[2]。现代养殖业中的过量脂肪是畜禽业面临的主要问题之一[3-4]。羊尾脂是指绵羊尾内部的大体积脂肪，可食用，目前多用于日化产品的开发。此外，羊尾脂具有药用价值，广泛应用于新疆少数民族医药[5]。但过多的脂肪沉积不利于生产者和消费者，因为浪费了膳食能量，同时也产生了经济价值较低的产品，降低产量，因此，减少脂肪产生，以及减少脂肪在身体和尾部的沉积，是绵羊产业的主要目标[6]。

和田羊和小尾寒羊都是新疆地区广泛养殖的肉羊品种，相比于阿勒泰大尾羊，和田羊和小尾寒羊的尾脂沉积较少。有报道称，油红O染色下，小尾寒羊尾脂脂肪细胞多呈形态均匀的卵圆形[7]，但对于和田羊尾脂的形态学研究和二者的羊尾脂脂肪细胞的显微、超微结构鲜有报道。本研究通过光学显微镜和透射电镜技术，主要研究和田羊和小尾寒羊尾部脂肪细胞显微、超微结构的特点与异同，为进一步探究羊尾部脂肪的形成机制，调控羊尾部脂肪过度沉积奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试剂

选择15月龄成年雄性和田羊和小尾寒羊共12只，按品种分为2组，每组6只，去除毛皮的新鲜尾部脂肪，通过2.5%的戊二醛固定液(电镜保存方法)、速冻方法来保存样品(冰冻切片保存)。

无水乙醇、二甲苯、丙酮购自于天津市化学试剂厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠购自于立杰国际贸易有限公司；苦味酸、液体石蜡、中性树胶、油红O染色液均购自于乌鲁木齐市阜瑞克生物科技有限公司；戊二醛、锇酸购自于金川集团有限公司技术中心；柠檬酸铅、醋酸铀购自于湖北楚盛威化工有限公司； Epon 812 包埋剂、OCT冰冻切片包埋剂购自于上海易微信息科技有限公司；环氧树脂512、十二烷基琥珀酸(DDSA)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、二乙基苯胺(DEA)、氢氧化钠、重蒸水、三氯甲烷配制的0.25%福尔蒙瓦尔膜、浓H2SO4均为市售。

1.2 脂肪组织冰冻切片制备

1.2.1 样本固定

样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4 ℃冰箱预冷5～10 min再用OCT胶浸透包埋组织块。取下组织并置于锡箔或者玻片上，并将其放置样品托上，再添一层OCT胶，完全覆盖，置速冻架(PE)上30 min。

1.2.2 冰冻切片

恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5～10 μm。切片时，低温室内温度以-15～-20 ℃为宜，切好的切片室温放置30 min后，烘箱干燥20 min，室温自然冷却。

1.3 油红O染色法

1.3.1 油红O染色液配制

饱和油红O原液按油红O∶蒸馏水=3∶2加入蒸馏水，混匀，室温放置5～10 min ，过滤后使用。

1.3.2 染色步骤

切片用甲醛-钙固定10 min；蒸馏水充分洗涤；60%异丙醇浸洗；油红O染液染色10 min(染液可回收再利用)；60%异丙醇分化至间质清晰；蒸馏水洗；Mayer苏木素复染；蒸馏水洗；甘油明胶封片。

显微镜观察结果：组织细胞中脂滴呈鲜红色，细胞核呈蓝紫色，间质无色。60%异丙醇分化，可在镜下控制至脂肪组织呈鲜红色，间质无色。

1.4 脂肪组织透射电子显微镜镜样品制备

剪取一小块组织，用双面刀片将材料切成约1 mm × 1 mm × 3 mm的长块，逐一放入盛有预冷的新鲜2.5%戊二醛固定液的小管中，放入冰箱4 ℃低温固定24～48 h 。

取和田羊和小尾寒羊尾部脂肪组织样 1 mm3，用 2.5%戊二醛固定液固定24 h，然后以0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液清洗3 ～ 5 次，15～20 min/次；再用 2%锇酸固定3 h 。固定后用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液清洗样品，重复3～5 次，15～20 min/次；将固定的样品分别在30%、50%、70%、80%、90%、100%系列浓度乙醇由低到高逐级加入到原固定瓶中脱水，各浓度脱水15 min；脱水后分别在无水乙醇∶丙酮(比例为1∶1)、无水乙醇∶丙酮(比例为 1∶4)、纯丙酮中置换，各30 min；置换后用 Epon 812 包埋剂∶丙酮(比例为1∶1)、Epon 812 包埋剂∶丙酮(比例为4∶1)、Epon 812 包埋剂渗透，各3 h ；渗透后用 Epon 812 包埋剂进行包埋，聚合条件为37 ℃聚合12 h ，45 ℃聚合12 h，60 ℃聚合48 h ；对聚合好的聚合块进行修块、切片，超薄切片厚度为70～100 nm；用醋酸铀染色液和柠檬酸铅染色液分别染色20 min，然后再用水冲洗；将染色后的铜网放在铺有滤纸的平皿中晾干，将染色好的切片置透射电子显微镜下，观察并记录细胞内细胞器的超微结构。

2 结果与分析

2.1 和田羊、小尾寒羊尾脂脂肪组织显微结构

光学显微镜下观察，结果如图1所示。脂肪组织切片染色均匀，脂滴无色，细胞核呈蓝紫色紧贴于细胞膜的一侧。视野下可见和田羊尾脂的脂肪细胞呈扁椭圆形，排列紧密，间质结构较少，细胞数量多(图1A)；小尾寒羊尾脂细胞脂滴较大，细胞轮廓清晰，间质结构多，细胞数量少(图1B)。由图2可见，和田羊和小尾寒羊尾脂脂肪细胞间的长径差异不显著(P>0.05)，和田羊尾脂脂肪细胞短径和细胞面积极显著小于小尾寒羊(P<0.01)。

A.和田羊尾脂；B.小尾寒羊尾脂

A. 脂肪细胞长径长度；B. 脂肪细胞短径长度；C. 脂肪细胞面积；数据为“平均数±标准误”，**表示差异极显著(P<0.01)

2.2 和田羊、小尾寒羊尾脂脂肪细胞超微结构的比较

2.2.1 和田羊尾脂脂肪细胞超微结构

在透射电镜不同放大倍数下，均不能观察到一个完整的尾脂脂肪细胞。如图3所示：透射电镜下连续观察显示，双层膜明显(图3A、图3B)，尾脂脂肪细胞内可见一个融合的大脂滴，细胞质和细胞核位于细胞内一侧的边缘，占据较少空间。细胞周围的薄层细胞质中含一般的细胞器，如线粒体、内质网等(图3B～图3D)，内质网表面光滑，呈螺旋状紧密排列(图3E、图3F)。细胞膜外侧发现有特殊的“绒毛状”结构，并且周围分布着较多的黑色点状颗粒(图3E、图3G)，细胞核清晰可见，核膜电子密度较高，边缘清晰，核质电子密度比胞质高(图3H)。

图中阿拉伯数字1为双层膜，2为脂滴，3为线粒体，4为绒毛状结构，5为内质网，6为细胞核，7为核仁，8为细胞间质

2.2.2 小尾寒羊尾脂脂肪细胞超微结构

小尾寒羊尾脂肪细胞内细胞器丰富，在电镜视野下可以观察到一个完整的脂肪细胞，如图4所示。镜下连续观察结果显示，脂肪细胞细胞膜及细胞间质较宽，在脂肪细胞交界处，清晰可见许多大小、外形不一、散在的脂肪滴(图4A、图4B)。细胞中细胞器的特点是：可见内质网密集排列，表面光滑，细胞质内散在分布有大量肿胀呈空泡状的线粒体，其线粒体在大小、外形及线粒体嵴的排列上也有差异(图4C至图4G)。此外，在细胞膜的外侧未见明显“绒毛状”结构。 脂肪细胞间隙中细胞核体积较大，核仁染色质丰富 (图4E)。

图中阿拉伯数字1为双层膜，2为脂滴，3为线粒体，4为绒毛状结构，5为内质网，6为细胞核，7为核仁，8为细胞间质

3 讨论

试验选用的小尾寒羊是经杂交选育的优良品种，毛质细软、净肉率高、肉质好、尾较小、尾脂短[8]，而和田羊是新疆和田地区特有的地方品种，具有耐干旱、耐粗饲的特点，体格小，产肉性能低、尾短瘦，因此，在已知和田羊与小尾寒羊尾部外观形态差异的基础上，试验观察并比较了尾部脂肪细胞组织学和超微结构的异同。结果显示，和田羊尾脂脂肪细胞呈椭圆形，胞内细胞器丰富，内质网呈螺旋状分布，线粒体于细胞内边缘分布，膜外有“绒毛状”结构和散在的黑色颗粒，这一特殊结构与在阿勒泰大尾羊尾脂脂肪细胞的细胞膜外侧发现的“发丝状”结构相似[9]，但其生理功能有待进一步研究。小尾寒羊尾脂脂肪细胞体积大，细胞间质宽，胞内有丰富的未融合的小脂滴，内质网排列整齐并片状结构清晰，线粒体散在分布在细胞质内。和田羊和小尾寒羊尾脂脂肪细胞形态结构具有明显差异。由于试验动物均来自规模化养殖场，所以推测这种差异可能与其遗传特性、脂肪沉积或相关脂代谢基因的存在或表达与否有关。

实验室前期有研究结果显示，脂肪与肥胖相关基因(FTO)基因表达水平在阿勒泰大尾羊和小尾寒羊之间存在品种间的差异[1]。绵羊品种之间的比较转录组的研究表明，尾脂形成差异也与脂质、脂肪酸代谢相关途径和细胞连接相关的途径(如细胞黏附分子)有关[6,10-13]。上述研究结果表明到基因在绵羊尾部脂肪形成和脂质代谢中的重要作用。随着羊尾部脂肪沉积基因调节网络的完善，相关的研究技术有望应用于绵羊优良品种的选育、调节羊体脂质代谢，进而改善绵羊肉质和提高畜牧生产效益。

总之，本次试验通过对和田羊和小尾寒羊尾脂显微、超微结构的观察，对不同品种羊尾脂细胞的超微结构特点有初步的了解，对探究羊尾部脂肪的形成、脂肪代谢机制及种间差异的形成机制具有重要意义。