添加延胡索酸二钠对水牛瘤胃体外发酵、脂肪酸组成及关键微生物数量的影响

郭艳霞，李孟伟，唐振华，彭丽娟，彭开屏，梁辛，谢芳，杨承剑

(中国农业科学院广西水牛研究所/农业部(广西)水牛遗传繁育重点实验室，广西 南宁 530001)

延胡索酸及其钠盐，安全无毒，作为饲料添加剂在单胃动物饲料中广泛使用，可作为酸化剂、抗应激剂和防腐剂。在反刍动物中，延胡索酸是瘤胃发酵的中间产物，可作为电子受体，是抑制瘤胃甲烷生成和生成丙酸的重要前体物[1]。有研究表明，在体外条件下添加延胡索酸二钠能提高瘤胃总挥发性脂肪酸(TVFA)和丙酸浓度[2]，且能促进纤维素分解菌增殖及对纤维素的消化[3]。关于延胡索酸及其钠盐对甲烷产量影响效果报道有所不同。Li等[4]在萨能奶山羊饲粮中添加延胡索酸，延胡索酸竞争性的利用甲烷生成过程中的氢而抑制了瘤胃甲烷产量，对干物质降解率无显著影响。而Beauchemin等[5]研究结果表明，延胡索酸盐不能有效地减少甲烷产量。延胡索酸及其钠盐没有降低甲烷排放原因可能是由于瘤胃中延胡索酸分解生成乙酸，产生氢气，分解产生的氢气抵消了其消耗的氢气，没有使甲烷产量发生变化。延胡索酸及钠盐影响瘤胃发酵主要是通过影响瘤胃微生物对代谢氢的利用[6]，而瘤胃微生物对氢的代谢也可能会影响不饱和脂肪酸的生物氢化过程，因为氢化途径中包含多步氢的利用和电子的传递[7]。目前关于通过添加延胡索酸及钠盐的方式来降低瘤胃甲烷生成是否影响脂肪酸生物氢化途径进的研究尚未见有报道。所以，本试验选择在体外培养条件下添加不同浓度延胡索酸二钠来研究延胡索酸二钠对瘤胃发酵参数、瘤胃脂肪酸组成以及关键微生物数量的影响。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选择3头体重约为(650±50)kg安装永久性瘤胃瘘管的水牛作为瘤胃液的供体动物。体外发酵底物的精粗比为40∶60(风干基础)，底物饲料分为精饲料(豆粕 25%，玉米15%)和粗饲料(象草60%)，其营养成分见表1。试验所用豆粕、玉米、象草均采自广西水牛研究所，经65 ℃烘干制成风干样后，粉碎过40目筛用于体外发酵。通过体外批次培养法(重复试验2次，2次对照组产气量相对偏差小于10%)，采用单因素试验设计，共设4个组，每组处理设5个重复，延胡索酸二钠(分析纯)添加水平分别为0(对照)、1、2、3 mg/mL(mL指瘤胃缓冲液和瘤胃液的总体积)，在每组各添加0.25 mg/mL的α-亚麻酸(纯度≥99%，购于美国Sigma公司)，为了更好观察脂肪酸生物氢化过程。在体外试验培养3、6、9 、12、24 h时，分别测定产气量和甲烷含量。在培养24 h结束后测定培养液pH值、氨态氮(NH3-N)、微生物蛋白(MCP)、挥发性脂肪酸(VFA)、脂肪酸及关键瘤胃微生物数量。

表1 底物组成及营养水平(风干基础)

1.2 培养方法

采用体外批次培养法，人工瘤胃缓冲液的配制参照Menke等[8]的方法。根据试验设计，准确称取发酵底物500 mg(300 mg象草粉+125 mg豆粕粉+75 mg玉米粉)，置入180 mL厌氧培养瓶中，分别添加不同剂量的延胡索酸二钠。将乳化后的α-亚麻酸液按相应设定比例加入到培养瓶中，持续通入CO2气体保持厌氧环境，加入人工瘤胃缓冲液40 mL，然后用橡胶塞和铝盖密闭，置于39 ℃水浴锅预热。在早饲前抽取3只瘘管水牛的瘤胃液，混合后经4层纱布过滤，将过滤后的瘤胃液，加入经预热处理过、且有充足CO2气体的保温瓶中，密封带回实验室。抽取瘤胃液20 mL加入到已升温至39 ℃的培养瓶中，混匀。置于恒温水浴摇床中，水浴温度(39.0±0.5)℃，振荡频率50 r/min。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 总产气量和甲烷产量的测定

在体外培养3、6、9 、12、24 h时，分别测定产气量和甲烷产量。取一注射器针头，用一软细短管将100 mL润滑的玻璃注射器与针头连接，将针头插入发酵瓶橡胶塞，读取注射器上的刻度并记录数据，测定方法参考文献[9]。

培养瓶净产气量=时间段产气量-对应时间段空白均产气量。

24 h累积总产气量即各时间段培养瓶净产气量相加之和。

用注射器测完产气量后，旋转管塞排出管内气体，然后再测定甲烷含量。甲烷含量利用气相色谱仪(Agilent 7890A，美国安捷伦科技公司)测定。用手动进样针从发酵瓶抽取10 μL气体，直接进样至气相色谱仪，色谱柱为 HP-INNOWAX (19091N-133) 毛细管柱，规格为30 m × 0.25 mm × 0.25 μm 。测定条件为：柱温80 ℃；气化室温度100 ℃；检测室温度120 ℃；载气为高纯氮气(压力为179.5 pa，总流量为46.2 mL/min，柱流量为2.7 mL/min，分流比15∶1，吹扫流量3 mL/min，循环流量100 mL/min)，氢气流量40 mL/min，空气流量400 mL/min。

1.3.2 体外发酵参数的测定

pH值测定：在瘤胃培养液培养24 h结束后时，将发酵瓶取出马上放进冰水混合物中，冷却15 min终止发酵。开瓶检测瘤胃培养液pH值，测定前将pH计(HANNA HI 8424，上海何亦仪器仪表有限公司)先用缓冲液进行校正，然后取10 mL培养液，用pH计测定培养液pH值。

NH3-N含量的测定：在培养24 h结束时，吸取4 mL培养液，加入4 mL 0.2 mol/L HCl进行酸化，冷冻保存。在4 ℃下解冻，采用苯酚-次氯酸钠比色法[10]，用紫外可见分光光度计(PE Lambda 35，上海普迪生物技术有限公司)，在630 nm波长条件下比色，根据吸光度和标准曲线换算出NH3-N含量。

MCP含量的测定：在培养24 h结束时，吸取8 mL培养液于离心管里，冷冻保存待测。测定采用考马斯亮蓝G250染色法，必要时可稀释，用紫外可见分光光度计(PE Lambda 35，上海普迪生物技术有限公司)在595 nm波长条件下比色，根据吸光度和标准曲线换算出MCP含量。

VFA含量的测定：在培养24 h 结束时，吸取1 mL 培养液，加入8.2%的偏磷酸0.5 mL，4 ℃下，20 000 g离心10 min，取离心后的上清液920 μL，加入内标物巴豆酸(1 mol/L)80 μL，采用气相色谱仪测定。测定条件：气化室温度200 ℃；检测室温度220 ℃；柱温采用程序升温，80 ℃持续1 min，以15 ℃/min升温至170 ℃后维持1.5 min；载气为高纯氮气(压力100 kpa，总流量63.8 mL/min，柱流量1.19 mL/min，分流比50∶1，吹扫流量3 mL/min，循环流量30 mL/min)；氢气流量40 mL/min，空气流量400 mL/min；进样量2.0 μL。

1.3.3 瘤胃液中长链脂肪酸含量的测定

瘤胃液中长链脂肪酸含量的测定参照Tianle等[11]方法，利用气相色谱仪，应用毛细管气相色谱-氢火焰离子化检测器(GC-FID)，自动进样器(Agilent G4513A，美国安捷伦科技公司)，HP-88脂肪酸甲酯测定专用毛细管柱，C17:0内标法检测中长链脂肪酸含量。

1.3.4 瘤胃微生物数量的测定

瘤胃液微生物总DNA的提取参照Denman等[12]的方法，采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取DNA。用超微量分光光度计(NanoDrop ND-2000，北京欣兴强森生物科技有限公司 )测定DNA的纯度和浓度。

瘤胃液微生物数量的测定采用实时荧光定量PCR方法，仪器是高通量实时荧光定量PCR仪(LightCycler 480，美国)，具体操作参照Shingfield等[13]方法。瘤胃液微生物的引物序列见表2，引物由上海生工生物工程公司合成。

表2 实时荧光定量PCR引物序列

1.4 数据统计与分析

采用Excel软件整理统计试验数据，SPSS 18.0 统计软件ANOVA过程进行单因子方差分析，差异显著性以P<0.05为判断标准，试验结果以“平均数±标准误”表示。

2 结果

2.1 添加延胡索酸二钠对体外发酵总产气量和甲烷产量的影响

不同浓度延胡索酸二钠对体外发酵24 h累积总产气量和甲烷产量的影响见表3。由表3可得知，添加延胡索酸二钠对体外发酵24 h累积总产气量和甲烷产量没有显著性影响(P>0.05)。

表3 不同浓度延胡索酸二钠对体外发酵总产气量和甲烷产量的影响

2.2 添加不同浓度延胡索酸二钠对瘤胃体外发酵发酵参数的影响

添加不同浓度延胡索酸二钠对体外发酵参数的影响见表4。添加2 mg/mL、3 mg/mL延胡索酸二钠，其培养液的pH值、TVFA含量均显著高于对照组(P<0.05)；丙酸含量也随着延胡索酸二钠添加量的增加而显著升高(P<0.05)，乙酸/丙酸随着延胡索酸二钠添加量的增加而显著降低(P<0.05)。添加延胡索酸二钠对其他几种VFA含量的影响差异不显著(P>0.05)。添加延胡索酸二钠对NH3-N浓度和MCP含量没有显著性影响(P>0.05)。

表4 不同浓度延胡索酸二钠对瘤胃体外发酵参数的影响

2.3 添加不同浓度延胡索酸二钠对瘤胃脂肪酸组成的影响

添加不同浓度延胡索酸二钠对瘤胃脂肪酸组成的影响见表5。添加延胡索酸二钠后，C18:3n6含量显著高于对照组(P<0.05)；添加3 mg/mL延胡索酸二钠，C6:0、C8:0和C14:1n5含量显著低于对照组(P<0.05)；添加1 mg/mL延胡索酸二钠，C18:2n6c、c9,t11-CLA和C20:1含量显著高于对照组(P<0.05)；添加1 mg/mL、2 mg/mL延胡索酸二钠组C22:2n6含量显著高于其他组(P<0.05)；添加延胡索酸二钠对其他脂肪酸组成的含量影响差异不显著(P>0.05)。

表5 不同浓度延胡索酸二钠对瘤胃脂肪酸组成的影响 μg/mL

2.4 添加不同浓度延胡索酸二钠对瘤胃相关微生物数量的影响

不同浓度延胡索酸二钠对瘤胃微生物数量的影响见表6。添加2 mg/mL延胡索酸二钠，瘤胃液的真菌、溶纤维丁酸弧菌、非典型丁酸弧菌和蛋白分解丁酸弧菌的数量显著升高(P<0.05)；添加2 mg/mL和3 mg/mL延胡索酸二钠，瘤胃液的原虫和产甲烷菌的数量显著高于其他组，且呈现相同的趋势；添加3 mg/mL延胡索酸二钠，瘤胃液的亨氏丁酸弧菌数量显著升高(P<0.05)；添加延胡索酸二钠对瘤胃液的总细菌数量影响差异不显著(P>0.05)。

表6 不同浓度延胡索酸二钠对瘤胃微生物数量的影响 copies/mL

3 讨论

延胡索酸二钠具有甲烷抑制潜能，在反刍动物中的应用已被多人研究。Baraz等[17]利用体外发酵，在饲料精粗比为50∶50的底物中添加8、10、12 mmol/L延胡索酸二钠显著降低了甲烷的产量，但对总产气量影响不显著。毛胜勇等[18]发现在不同日粮中添加4、7 mmol/L延胡索酸二钠，能显著提高累积产气量，降低甲烷产量，且在高牧草日粮组下降幅度最大。在本研究中，添加延胡索酸二钠对总产气量和甲烷产量影响差异不显著。本研究结果与以上报道不完全相同，原因可能是发酵底物和延胡索酸二钠添加量不同，最终通过延胡索酸-琥珀酸途径利用氢数量有所不同，进而导致在延胡索酸影响甲烷生成的效果上出现差异。毛胜勇等[18]曾报道，延胡索酸二钠抑制甲烷生成的效应，与发酵底物的天然特性有关，其中粗饲料添加比例越高，甲烷减少量越显著。

瘤胃pH值、NH3-N、MCP和VFA都是反映瘤胃内环境和瘤胃发酵模式的重要参数。本试验添加延胡索酸二钠后，瘤胃发酵液的pH值显著升高，对NH3-N浓度和MCP含量没有显著性影响。赖瀚卿等[19]研究表明，延胡索酸二钠能够显著提高瘤胃pH值，延胡索酸二钠具有一定的缓冲作用，可避免瘤胃过酸的不良影响。Yu等[3]利用体外培养法，在日粮中添加延胡索酸盐，NH3-N浓度随延胡索酸盐添加量的增加显著降低，并能促进对纤维素的分解。因为延胡索酸盐能够促进纤维分解菌等微生物对NH3-N的利用[3]，使瘤胃NH3-N浓度降低。姜宇晨等[20]发现，添加1%和2%延胡索酸二钠，瘤胃液丙酸和TVFA浓度升高，NH3-N浓度降低，但添加3%延胡索酸二钠，则瘤胃液NH3-N浓度上升，说明添加适量延胡索酸二钠可以促进游离氨氮形成微生物蛋白，有利于瘤胃发酵。Jin等[21]研究发现，体外添加延胡索酸二钠增加了丙酸、戊酸和TVFA浓度。Remling等[22]的研究也表明，添加延胡索酸二钠会提高乙酸和丙酸的含量，降低乙酸/丙酸。本研究添加延胡索酸二钠，显著提高了丙酸、TVFA产量，降低乙酸/丙酸，但对乙酸产量影响差异不显著。表明了延胡索酸二钠提高了瘤胃发酵能力，原因可能包括延胡索酸本身发酵和延胡索酸对整个发酵过程的影响。添加延胡索酸二钠瘤胃丙酸含量显著增加，可能意味着某些微生物能够与产甲烷菌竞争氢，将原本用于甲烷生成的氢，转移到生成延胡索酸二钠还原途径上，进而形成丙酸。

瘤胃中脂肪酸的代谢，对反刍动物乳和肉中脂肪酸组成及比例有重要影响，瘤胃中的微生物可影响多不饱和脂肪酸向饱和脂肪酸的转化，这一过程称为生物氢化。共轭亚油酸(CLA)主要就是由亚油酸和亚麻酸的异构化和不完全氢化作用形成的。脂肪酸氢化是利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)途径进行氢的转移。延胡索酸在瘤胃中可以还原成琥珀酸，进一步形成丙酸，此过程消耗氢。所以延胡索酸可能会通过干扰电子的转移来影响脂肪酸生物氢化。Ke等[23]在了青贮苜蓿添加苹果酸和柠檬酸，发现降低了饱和脂肪酸的比例，提高了多不饱和脂肪酸的比例，并且柠檬酸对青贮苜蓿脂肪酸生物加氢的抑制作用最强。此外，丁酸弧菌属细菌在瘤胃脂肪酸生物氢化中起重要作用[24]。Yang等[25]认为，丁酸弧菌数量的增加不影响脂肪酸生物氢化反应的进行，而王亚萍[26]认为，溶纤维丁酸弧菌、非典型丁酸弧菌、假丁酸弧菌属在内的一种或多种丁酸菌属的氢化菌数量增加会抑制瘤胃trans-10氢化路径。在本研究中，添加2 mg/mL延胡索酸二钠，瘤胃液的溶纤维丁酸弧菌、非典型丁酸弧菌、亨氏丁酸弧菌和蛋白分解丁酸弧菌数量升高，添加1 mg/mL、2 mg/mL延胡索酸二钠，VFA含量分别升高24.37%、26.37%，且1 mg/mL延胡索酸二钠显著提高了c9,t11-CLA含量。低浓度的延胡索酸二钠(1 mg/mL和2 mg/mL)可促进丁酸弧菌生长及提高VFA含量，随着延胡索酸二钠浓度的升高，丁酸弧菌数量和VFA反而逐渐恢复到与对照组基本一致的状态，但产甲烷菌数量反而达到最高值。推测原因是：低浓度的延胡索酸二钠可促进丁酸弧菌对氢的利用，从而降低了可用于脂肪酸生物氢化途径的氢，但高浓度情况下丁酸弧菌对氢的利用能力减弱，导致丁酸弧菌无法与产甲烷菌竞争氢。此结果与上述他人结果有所不同，因为生物氢化还受到多种因素的影响，包括饲粮中脂肪酸不饱和程度、微生物种类和瘤胃发酵条件等[27]。

反刍动物的瘤胃内存在着大量的严格厌氧微生物，包括原虫、厌氧真菌和细菌等。毛胜勇等[28]发现，延胡索酸二钠具有促进瘤胃微生物增殖的作用，从而提高累积产气量，降低甲烷产量，但在体外单独培养真菌添加延胡索酸二钠，延胡索酸二钠抑制了瘤胃真菌的增殖[18]。Yang等[29]也报道，在不同精粗比饲料中添加延胡索酸二钠，可以改变产甲烷菌和真菌的丰度，但没有影响到甲烷的产量。在本研究中添加2 mg/mL和3 mg/mL延胡索酸二钠，提高了产甲烷菌、原虫和丁酸弧菌数量，但是对甲烷生成量没有显著影响。此研究结果与他人报道不太一致，延胡索酸二钠对产甲烷菌和甲烷产量的影响效果不同，主要还是因为延胡索酸二钠添加量、饲喂方式及瘤胃发酵状况不同所致。由此可得，产甲烷菌的多少不能直接决定甲烷的产量，产甲烷菌影响甲烷产量的机理比较复杂，还有待研究。

4 结论

在体外条件下添加1 mg/mL延胡索酸二钠可以提高c9,t11-CLA含量，2 mg/mL和3 mg/mL延胡索酸二钠可以提高TVFA含量，增加瘤胃真菌、原虫、甲烷菌和丁酸弧菌的数量，促进了水牛瘤胃发酵性能。添加1～3 mg/mL延胡索酸二钠均能提高丙酸含量，但对甲烷产量没有显著影响。