贵州省2017-2018年非伤寒沙门菌临床分离株耐药及分子分型研究

龙 利，游 旅，韦小瑜，，李世军，王 丹，黄俊飞，童 毅，郭 华，王 铭，汪俊华

非伤寒沙门菌(Non-typhoidal Salmonella, NTS)是引起人类感染性腹泻和食物中毒最为常见的肠道致病菌之一，其感染呈全球分布[1]。全球疾病、伤害和风险因素负担研究估计，2017年发生NTS侵袭性疾病53.5万例，造成77 500例死亡[2]。相关研究显示，我国食源性NTS感染每年发病约903.5万人次，每年死亡估计792人，且呈上升趋势[3]。贵州省也是沙门菌感染的高发省份，以往对贵州省腹泻患者的细菌病原学监测显示，NTS是引起感染性腹泻的主要病原菌[4-5]。由NTS感染引起的暴发事件在贵州省时有发生，2011-2016年全省共有食源性疾病暴发事件486起，其中细菌性暴发事件52起，沙门菌位列细菌性暴发事件的前3位[6]。因此对NTS的监测和防控预警都应引起足够的重视。

据报道，贵州省受污染的禽类制品、食品中NTS分离率较高，且表现出高耐药性[7-8]，但关于临床上NTS的耐药性和分子分型的相关研究未有系统性的报道。本研究对2017-2018年贵州省NTS临床分离株的耐药性及PFGE分子分型进行分析，为贵州省沙门菌的防控提供相关的实验室数据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 以贵州省17家哨点医院为监测点，除了2家为妇幼保健院，其余15家均为综合性医院。将符合以下两条及以上的患者列为沙门菌监测对象：1)24 h内连续腹泻3次及以上且伴有稀便、水样便、粘液便等粪便性状异常者；2)出现发热，体温达38 ℃以上，伴有头痛、寒战、全身乏力等症状；3)出现呕吐、腹泻、腹痛等症状。2017年1月至2018年12月，共收集到191株NTS菌株。质控菌株布伦登卢普沙门菌(H 9812)和大肠埃希菌(ATCC 25922)。

1.2 主要试剂和仪器XbaI酶为大连宝生物工程有限公司产品；沙门菌显色培养基为法国CHROM Agar公司产品；API20E生化鉴定条为法国生物梅里埃公司产品；沙门菌诊断血清为丹麦SSI公司产品；蛋白酶K为德国Merck公司产品；革兰阴性需氧药敏检测板为上海星佰生物技术有限公司产品；CHEF MapperTM脉冲场电泳仪、Gel Doc2000凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品。

1.3 菌株的复核及血清分型 菌株接种至科玛嘉沙门菌显色培养基上，36 ℃培养过夜,从培养基上挑取淡紫色可疑菌落接种至克氏双糖和动力-靛基质-尿素培养基进行初步生化鉴定。符合沙门菌初步生化的菌株进一步采用API20E生化鉴定板条进行系统生化鉴定,对明确鉴定为非伤寒沙门菌的菌株转种至血琼脂平板，36 ℃培养18～24 h。挑取少许菌苔进行沙门菌O、H相多价、单价玻片血清凝集，生理盐水作阴性对照。根据White-Kauffmann-Le Minor抗原表确定对应血清型别。

1.4 药物敏感性试验 采用美国临床与实验室标准化协会(CLSI2017)推荐的微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)。本实验共测定10类16种抗生素，环丙沙星、链霉素、氨苄西林、氯霉素、磺胺异恶唑、复方新诺明、萘啶酸、阿莫西林/克拉维酸钾、头孢曲松、多西环素、庆大霉素、阿奇霉素、四环素、头孢西丁、头孢吡肟、亚胺培南。ATCC 25922作为质控菌株，Whonet 5.6软件分析结果，操作过程参照文献[9]。3类或以上抗生素同时耐药定义为多重耐药株(Multi-drug resistance，MDR)。

1.5 PFGE分子分型 根据国际PulseNet网络实验室公布的沙门菌PFGE标准分型方法，对分离的非伤寒沙门菌进行PFGE分子分型，H 9812作为质控菌株。XbaI 37 ℃酶切3 h，Gelred染色30 min，纯水脱色10 min，用Gel Doc 2000凝胶成像系统拍摄图像并将其保存。上传条带至 BioNumerics软件包(Version7.6)对指纹图谱进行识别、处理，使用非加权配对算术平均法(unweighted pair group method with arithmetic averages,UPGMA)进行菌株聚类分析。

2 结 果

2.1 NTS地区分布及血清型分布 2017-2018年共分离出NTS 191株，其中2017年105株(55.0%)，2018年86株(45.0%)。共分出18种血清型，有8株血清型未分型，其中鼠伤寒沙门菌87株(45.5%)，肠炎沙门菌56株(29.3%)，这两种血清型为贵州省NTS主要血清型。贵阳市、安顺市、黔东南州以鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌为主；六盘水市以肠炎沙门菌和伦敦沙门菌为主；遵义市以鼠伤寒沙门菌为主，其次为德尔卑沙门菌；毕节市和黔南州以肠炎沙门菌为主。菌株的地区分布和血清型分布见表1。

表1 贵州省2017-2018年非伤寒沙门菌各地区血清型分布

2.2 NTS药敏实验结果 96.8%(185/191)的菌株对至少一种抗生素产生耐药。对磺胺异恶唑(82.7%，158/191)、链霉素(81.7%，156/191)、氨苄西林(80.6%，154/191)、四环素(68.1%，130/191)、多西环素(63.4%，121/191)高度耐药。NTS对一代喹诺酮类药物萘啶酸耐药率较高，达48.2%(92/191)，对三代氟喹诺酮类药物环丙沙星耐药率为13.1%(92/191)，中介率达68.1%(130/191)。头孢菌素类药物中，第三代头孢曲松耐药率最高，为7.9%，第四代头孢吡肟和第二代头孢西丁耐药率分别为6.3%(12/191)、1.6%(3/191)。出现7株对环丙沙星和头孢曲松共同耐药的菌株，占所有菌株的3.7%(7/191)，在这7株菌中，有3株还对阿奇霉素耐药。此外，还出现2株菌对亚胺培南耐药。优势血清中，鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌两者均对链霉素、氨苄西林、磺胺异恶唑产生较高的耐药率，在78%～91%之间。鼠伤寒沙门菌对氯霉素(66.3%，58/87)、复方新诺明(59.3%，52/58)、多西环素(80.2%，70/87)、四环素(81.4%，70/87)耐药性较高，肠炎沙门菌对萘啶酸耐药性高度耐药，耐药率达96.5%(54/56)。各种抗生素的药敏结果见表2。

表2 贵州省2017-2018年非伤寒沙门菌耐药情况(%)

2.3 耐药谱 191株NTS菌株共形成69种耐药谱型，主要谱型为：氨苄西林+链霉素+磺胺异恶唑+萘啶酸(28株，14.7%)和氨苄西林+氯霉素+链霉素+磺胺异恶唑+四环素+多西环素+复方新诺明(27株，14.1%)。87株鼠伤寒沙门菌形成38种耐药谱型，以氨苄西林+氯霉素+链霉素+磺胺异恶唑+四环素+多西环素+复方新诺明(21株，24.1%)为主要耐药谱型，其次为氨苄西林+氯霉素+磺胺异恶唑+多西环素(11株，12.6%)。56株肠炎沙门菌形成18种耐药谱型，氨苄西林+链霉素+磺胺异恶唑+萘啶酸(27株，48.2%)为主要耐药谱型，其次为氨苄西林+链霉素+磺胺异恶唑+萘啶酸+四环素+多西环素(7株，12.5%)。

2.4 多重耐药 2017-2018年贵州省NTS多重耐药率为84.3%(161/191)，鼠伤寒沙门菌多重耐药率为90.8%(79/87)，肠炎沙门菌多重耐药率为83.9%(47/56)。多重耐药菌株中，对5类抗生素耐药的最多，占比为38.5%(62/161)，其次为4耐类，占比为32.3%(52/161)。一部分菌株出现对6类及以上的抗生素耐药，6耐类抗生素的菌株有22株，7耐类抗生素的菌株有13株，8耐类抗生素的菌株有5株，9耐类抗生素的菌株有1株。各市(州)均分离到多重耐药菌株，多重耐药率最高的是铜仁市(91.4%，53/58)，其次是安顺市(90.5%，19/21)和六盘水市(90.0%，9/10)，其余市(州)多重耐药率分别为：贵阳市(88.2%，30/34)、黔东南州(85.0%，17/20)、黔南州(83.3%，10/12)、遵义市(64.3%，18/28)、毕节市(62.5%，5/8)。

2.5 PFGE分子分型和聚类分析 所有NTS菌株经XbaI酶切电泳后，188株菌株得到较好分离，有3株未跑出条带。按照PFGE图谱相似度为100.0%时为同一型别，对主要血清型鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌分别进行PFGE图谱聚类分析。

2.5.1 鼠伤寒沙门菌聚类分析结果 87株鼠伤寒沙门菌经PFGE分型后，共获得60种带型，命名为JPXX01.GZ0001～JPXX01.GZ0060。11种带型包括2株及以上的菌株，优势带型JPXX01.GZ0047有11株(12.6%),包括贵阳市4株，铜仁市4株，遵义市2株；JPXX01.GZ0051有5株(5.7%)，JPXX01.GZ0038、JPXX01.GZ0042、JPXX01.GZ0046各有3株(3.4%)，6种带型各有2株(2.3%)，其余53种带型均为1株(1.1%)。3种带型跨年份交叉出现，5种带型跨地区出现，JPXX01.GZ0047、JPXX01.GZ0050、JPXX01.GZ0051存在跨地区跨年份带型相同的菌株。观察同一带型菌株的耐药谱发现，有4种带型的同源菌株耐药谱完全一致；而有一部分耐药谱相同的菌株没有聚类特征，如主要耐药谱氨苄西林+氯霉素+链霉素+磺胺异恶唑+四环素+多西环素+复方新诺明分布在11个型别中(见图1)。

注：“Resistance profile”中ACSSuTNDG分别表示氨苄西林、氯霉素、链霉素、磺胺异恶唑、四环素、萘啶酸、多西环素、庆大霉素，CIP、SXT、AMC、AZM、CRO、FOX、FEP、IMP分别表示环丙沙星、复方新诺明、阿莫西林/克拉维酸钾、阿奇霉素、头孢曲松、头孢西丁、头孢吡肟、亚胺培南，”——“表示敏感

2.5.2 肠炎沙门菌聚类分析结果 56株肠炎沙门菌经PFGE分型后，共获得21种带型，命名为JEGX01.GZ0001～JEGX01.GZ0021。6种带型包含2株及以上的菌株，其中JEGX01.GZ0005有13株(23.3%),为优势带型，包括铜仁市5株，黔东南州3株，安顺市3株，黔南州2株；次优势带型JEGX01.GZ0007有12株(21.4%)，分布于5个地市(州)；JEGX01.GZ0004有8株(14.3%)，JEGX01.GZ0001有4株(7.1%)，2种带型各有2株(3.6%)，其余15种带型均为1株(1.8%)。有3种带型存在跨地区跨年份带型相同的菌株。结合PFGE带型与耐药谱分析结果显示，氨苄西林+链霉素+磺胺异恶唑+萘啶酸和氨苄西林+链霉素+磺胺异恶唑+四环素+萘啶酸+多西环素为JEGX01.GZ0005的主要耐药谱，JEGX01.GZ0007的优势耐药谱为氨苄西林+链霉素+磺胺异恶唑+萘啶酸，其余带型的耐药表型分布较为分散，见图2。

注：“Resistance profile”中ACSSuTNDG分别表示氨苄西林、氯霉素、链霉素、磺胺异恶唑、四环素、萘啶酸、多西环素、庆大霉素，CIP、SXT、AMC、AZM、CRO、FOX、FEP、IMP分别表示环丙沙星、复方新诺明、阿莫西林/克拉维酸钾、阿奇霉素、头孢曲松、头孢西丁、头孢吡肟、亚胺培南

3 讨 论

NTS是一类危害动物和人类健康的重要人兽共患致病菌，给全球的公共卫生造成重大的负担[2-3]。血清型分型是NTS重要的表型之一，也是流行病学研究的基础，有助于实现病原微生物的溯源分析，对NTS的防控和风险评估具有重要意义。贵州省2017-2018年NTS临床患者血清型分布呈现多样性，主要血清型为鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌，与广州市、重庆市报道的结果相似[10-11]，与安徽省马鞍山市报道的阿贡纳沙门菌为当地的优势血清型有所区别[12]，说明NTS血清型分布有一定的区域特点。贵州省各市(州)分离的菌株中，菌株数多的三个市(州)为铜仁市、贵阳市、遵义市，其原因可能与各市(州)沙门菌的流行情况，标本的采样及分离技术、送检是否及时有关，提示在今后的监测工作中需加强对各监测点的培训及监测力度，完善相关工作。各地区主要血清型别有所差异，提示实时监测全省NTS的动态变化至关重要，针对各地区流行的血清型做好防控措施。

国内外研究显示，耐药性NTS近年来引起了全球的关注，成为医疗机构面临的重大问题[2,13]。本次药敏结果显示，磺胺异恶唑、链霉素、氨苄西林、四环素、多西环素耐药率超过60%，此结果高于2016年中国26个省市食源性沙门菌的整体耐药水平[14]。沙门氏菌受血清型的影响很大，部分血清型对某些抗菌药物表现出较高水平的耐药性。研究结果显示，鼠伤寒沙门菌对氯霉素、复方新诺明、多西环素、四环素表现出高度耐药，肠炎沙门菌对萘啶酸的耐药率和环丙沙星的中介率高于其他血清型，具体原因尚不清楚。

喹诺酮类和头孢菌素类抗菌药物目前分别是临床上治疗成人和儿童NTS感染使用最广泛的抗生素。在儿童中，头孢菌素对于治疗严重的腹泻和侵袭性NTS感染至关重要，若对头孢曲松这类超广谱头孢菌素耐药将会给临床上抗NTS感染增添更严重的问题。不同地区报道的头孢曲松耐药性有所不同，但总体呈上升趋势[15-16]。191株NTS菌株中，15株(7.9%)对头孢曲松耐药。各市(州)对头孢曲松耐药率在0%～19.0%之间，以安顺市(19.0%)最高，黔东南州(15.0%)次之。喹诺酮类抗菌药物中，萘啶酸耐药率较高，环丙沙星耐药率虽不是很高，但表现出非常高的中介率，这部分菌株应引起我们的重视。值得注意的是，本次药敏实验中，出现了对环丙沙星和头孢曲松、阿奇霉素共同耐药的菌株，阿奇霉素被证明治疗NTS感染的效果与超广谱头孢菌素类和氟喹诺酮类药相当，同时对这3种重要的抗生素耐药，若出现NTS暴发感染，临床治疗将变得非常困难。

NTS多重耐药的流行已成为人类健康的重大威胁，本次研究多重耐药率已超过80%，高于美国、欧盟报道的人源NTS分离株的多重耐药性[15,17]。铜仁市、安顺市、六盘水市的多重耐药菌株高达90.0%，远高于国内部分城市[7-8]。菌株的耐药谱结果显示，所有菌株共形成69种耐药谱型，优势耐药谱型与其他地区不同[9,13,18]，其原因可能与区域血清型别、抗生素的使用量和种类有关。在20世纪 80年代出现了一种典型的多重耐药表型DT104，表现出对氨苄西林、氯霉素、链霉素、磺胺类和四环素类抗菌药物同时耐药(即ACSSuT)，具有这种耐药模式的沙门氏菌感染者比敏感感染者可能住院时间更长和死亡[19]。本次研究有72株(38.0%)菌株出现这种耐药模式，若这种耐药模式的菌株持续存在，将会影响贵州省NTS感染患者的临床治疗。碳青霉烯类抗菌药物作为抗生素“多重耐药的一道防线”，菌株对该类药物产生抗性说明耐药现象严重[10]。此次研究，出现2株菌株对亚胺培南产生耐药，提示贵州省的NTS多重耐药形势严峻。

PFGE作为细菌分型的“金标准”，利用不同菌株的电泳图谱具有高度特异性，成为流行病学监测、感染控制和暴发调查中使用最广泛的方法之一[20]。经PFGE分型，除鼠伤寒、肠炎、德尔卑沙门菌中有一部分菌株有聚类特征外，其他血清型的沙门菌没有出现聚类现象，总体呈现多态性，与国内外研究相似[21-22]。肠炎沙门菌聚类结果显示，较多的菌株条带相似度为100.0%，表明贵州省存在肠炎沙门菌散发流行的可能，应做好早期预防和预警。鼠伤寒沙门菌PFGE型别分散、带型复杂，该血清型的菌株防控难度较大，应做好全方位的防控措施。这两种血清型均有跨年份跨地区的同一带型的菌株，表明可能在某些食品的原材料、加工、销售等环节中存在持续的污染源，人员的流动性、食品的贸易等使病原菌跨地区跨年份传播和蔓延。带型相同的菌株主要集中在菌株分离数较多的铜仁市、贵阳市和遵义市，呈地域的聚集性。鼠伤寒沙门菌JPXX01.GZ0006型的两株菌分离自同一天，均为铜仁市思南县分离株，且耐药表型相似，不排除这两株菌来源于同一感染源。本研究中，PFGE分型与耐药表型存在一定的相关性，根据这种关联性有助于发现耐药菌株。同时，耐药表型不同却出现相同的PFGE带型，提示不同菌株基因组的特性有所差异，后续可结合耐药基因检测进行更深入的研究。

利益冲突：无