烟草NNttGGCCNN22启动子的克隆及功能研究

翟春贺，王浩，李怡博，苏梦迪，郭豪，杨永霞，张松涛*

1 河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化研究基地，烟草行业烟草栽培重点实验室，河南郑州农业路63号 450002；

2 广东烟草韶关市有限公司，广东韶关北江中路27号 512000

真核翻译起始因子2（eukaryotic Initiation Factor 2，eIF2）是调控蛋白翻译起始阶段的关键因子。eIF2的α亚基发生磷酸化修饰后，可抑制蛋白质翻译起始。目前，在动物中已发现四种可磷酸化eIF2α的蛋白激酶，包括PKR（protein kinase double-stranded RNA-dependent）、HRI（heme-regulated inhibitor）、PERK（PKR-like endoplasmic reticulum kinase） 和GCN2（General Control Non-derepressible 2）。在动物和芽殖酵母中，当氨基酸缺乏时，GCN2介导的eIF2α磷酸化可以降低翻译起始速率，同时激活氨基酸合成相关基因的表达，从而应对氨基酸缺乏[1-2]。在植物中，目前只发现GCN2一种蛋白激酶可使eIF2α磷酸化，暗示着GCN2在植物营养缺乏中起重要作用。

植物GCN2在多种组织中均可表达。在拟南芥和烟草中，AtGCN2和NtGCN2在根、茎、叶、花中均可表达[3]。其中，NtGCN2在叶片中表达量最高，在根和茎中表达量最低。此外，GCN2还参与植物生长发育的调控。在拟南芥中，gcn2突变会导致种子萌发延迟，叶片变长，叶绿素含量降低[4]。GCN2还可以响应多种生物和非生物胁迫[5-10]。紫丁香假单胞菌和黄斑病菌ES4326侵染拟南芥时，GCN2被激活并磷酸化eIF2α，同时在侵染前期正调控ABA生物合成[11]。在烟草中，烟粉虱侵染也可以激活烟草GCN2的表达[13]。此外，低温、盐胁迫、UV辐射、干旱和冷害等非生物胁迫均能激活GCN2的表达[3,12-13]。

植物激素是由植物自身代谢产生的一类有机物质，在极低的浓度下就对植物生长发育有明显生理效应，在植物生长发育过程中起重要作用。研究发现，GCN2可被多种植物激素激活，包括壬二酸（AZA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）等[3,12-13]。茉莉酸甲酯和水杨酸均是植物生长发育及抗逆反应中起重要作用的内源性激素，其中水杨酸是植物系统获得性抗性（Systemic Acquired Resistance，SAR）的重要信号分子[14-15]，而茉莉酸甲酯参与了植物防御信号转导。喷施茉莉酸甲酯和水杨酸可激活AtGCN2[4,12]，表明GCN2可能在植物防御食草昆虫中发挥了重要作用。脱落酸（ABA）是一种应激激素，在植物遭受干旱和盐胁迫时迅速积累，参与植物逆境响应[16]。拟南芥受到病原菌侵染时，GCN2参与了ABA信号传导，进而关闭气孔，限制病原体进入[11]。AZA是植物生物胁迫和非生物胁迫下脂质过氧化的产物，它能够引起植物中SA的积累进而引发防御反应[17]。在拟南芥和烟草中，一定浓度的壬二酸处理可激活GCN2[3,12]。这些研究结果表明GCN2可以响应多种植物激素，广泛参与了植物对各种胁迫的应答。

目前启动子的相关研究主要集中在组织特异性启动子、诱导型启动子和合成启动子的发现和应用等方面[18-22]。组织特异性启动子如牵牛子绿色组织特异性PNZIP（pharbitis nil leucine zipper）启动子和烟草腺毛特异表达的TTR1启动子（Transthyretin 1）。前者可以驱动外源基因在绿色组织中高表达，后者可以在腺毛中特异表达外源基因。诱导型启动子PR1aP（Pathogenesis-related genes la）具有水杨酸诱导性[23-25]。合成启动子由核心启动子区和应答元件组合而成，也可以通过构建启动子文库合成[21]。研究发现，根特异性顺式作用元件模块与玉米泛素基因启动子PortUbi882（Porteresia ubiquitin）上86 bp核心序列融合而成的合成启动子可以驱动GUS基因在烟草的根部特异性表达[26]。此外，利用CRISPR/Cas9技术通过敲除或插入应答元件探究启动子功能也是启动子研究的一种重要手段[27]。

目前关于GCN2的研究大多集中在动物和芽殖酵母中[28-29]，植物GCN2的研究主要集中在模式植物拟南芥，但目前有关GCN2启动子的研究尚未见报道，其调控机制尚不明确。实验室前期研究发现烟草NtGCN2包含了NtGCN2-1和NtGCN2-2两个拷贝，二者在进化上分别来自于其亲本林烟草和绒毛状烟草[12]。本研究从烟草中克隆了NtGCN2-1上游2000 bp的启动子NtGCN2-Nsy-pro2000，构建了NtGCN2-Nsy-pro2000驱动的GUS基因表达载体，将其转化烟草后分析烟草NtGCN2启动子在不同植物激素处理下的表达模式，为进一步研究GCN2基因的转录调控机制提供了资料。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料：N. tabacumK326种植在河南农业大学烟草栽培生理生化研究基地实验室。

菌株和载体：pCAMBIA-NPT-GUS载体为河南农业大学烟草栽培生理生化研究基地保存，大肠杆菌Escherichia coliDH5α，农杆菌Agrobacterium tumefaciensEHA105感受态购于诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 启动子克隆及质粒构建

根据NtGCN2基因上游2000 bp序列设计引物（表1），以烟草K326基因组DNA为模板扩增NtGCN2上游启动子序列，将NtGCN2-Nsy-pro2000连接至pCAMBIA-NPT-GUS载体的HindIII和EcoRI位点，替代原有的35S启动子，将获得的表达载体pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS转化大肠杆菌E. coliDH5α，挑选阳性菌落鉴定后进行测序。

表1 本实验用到的引物Tab. 1 The primers used in this study

1.2.2NtGCN2启动子序列分析

采 用Plant CARE (http//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE数据库（https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace）分 析启动子序列并预测应答元件。

1.2.3 烟草遗传转化及PCR鉴定

采用农杆菌介导的叶盘转化法[30]将NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS片段转入烟草K326中，获得转基因株系。

提取转基因植株DNA，采用GUS-F/R引物进行PCR扩增。PCR反应程序：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，重复30个循环；72℃延伸10 min。

1.2.4 激素处理

选取在培养基中培养30 d的转基因烟苗进行处理，将过滤后的激素（1 mmol/L SA、0.1 mmol/L MeJA、0.1 mmol/L ABA、0.1 mmol/L AZA，SA、MeJA、 ABA和AZA购自生工生物工程有限公司）用干净的喷壶均匀喷洒到烟草幼苗上，分别在喷施0 h、24 h、48 h后取培养基上幼苗8～10棵用于GUS基因分析和GUS酶活性检测。

1.2.5 RNA提取及实时荧光定量PCR

采用艾德莱试剂公司植物总RNA快速通用试剂盒提取上述待测样品总RNA，诺唯赞生物科技有限公司HiScript® II Reverse Transcriptase试剂盒进行反转录。实时荧光定量PCR以转基因烟草cDNA为模板，采用L25和GUS上下游引物对进行定量PCR（表1）。反应体系为：2 μL模板，0.5 μL上下游引物，10 μL SYBR Green Mix，7 μL ddH2O。反应程序采用95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，重复30个循环；70℃-95℃获得溶解曲线。以L25为内参基因，采用2-ΔΔCT法计算定量结果。

1.2.6 GUS组织化学染色

取待测样品浸入-20℃预冷的90%丙酮，冰上静置15 min。将样品浸入GUS染液（10 mmol/L Na2EDTA、1 mmol/L K3[Fe(CN)6]、1 mmol/L K4[Fe(CN)6]、0.5% Triton X-100、20%甲醇、pH为7的100 mmol/L磷酸缓冲溶液、1 mg/mL X-Gluc），37℃过夜。采用75%～95%乙醇进行梯度脱色至透明，观察染色情况并拍照。

1.2.7 GUS酶活性分析

取100 mg待测样品液氮研磨粉碎，置入2 mL离心管，加入1 mL GUS酶提取液（100 mL pH为7的0.1 M 磷酸缓冲液，2 mL 10% SDS溶液，4 mL pH为8的0.5 M EDTA溶液，200 μL Triton X-100溶液，β-巯基乙醇200 μL，混匀后定容至200 mL），混匀后在12000 rpm离心5 min（4℃），将上清液转移至新的离心管，-80℃保存待用。

采用Bradford法测定蛋白浓度，取20 μL蛋白上清，加入80 μL 37℃预热的GUS酶提取液，再加入100 μL 底物MUG，37℃温浴30 min。365 nm激发波长，455 nm发射波长，狭缝10 nm条件下测定荧光强度，根据标准曲线计算酶活性。

2 实验结果

2.1 启动子序列克隆与分析

2.1.1NtGCN2-Nsy-pro2000启动子克隆与表达载体构建

以烟草K326基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果如图1A所示。对获得的重组载体进行PCR鉴定，结果如图1B所示。PCR扩增产物大小约为2000 bp，均与预期结果一致。测序结果表明pCAMBIANPT-NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS载体构建成功。

图1 PCR扩增NtGCN2-Nsy-pro2000片段与重组载体鉴定Fig.1 PCR amplification of the NtGCN2-Nsy-pro2000 and identification of the recombinant vector

2.1.2NtGCN2-Nsy-pro2000启动子序列分析

对获得的NtGCN2-Nsy-pro2000序列进行顺式作用元件分析发现，该序列含有高等植物启动子核心区域和上游调控区。其上游调控区分布着多种胁迫响应元件，包括干旱诱导元件（MBS）、脱落酸应答元件（ABRE）、与茉莉酸甲酯应答相关的基序（TGACG-motif）、乙烯应答元件（ERE）、光响应元件（AE-box）、厌氧诱导应答元件（ARE）以及参与防御和胁迫应答的元件（TC-rich repeasts）（表2）。

表2 NtGCN2-Nsy-pro2000顺式作用元件预测Tab. 2 Prediction of NtGCN2-Nsy-pro2000 cis-acting elements

将获得的NtGCN2-Nsy-pro2000与不同烟草中GCN2启动子序列进行比对分析。BLAST分析结果显示NtGCN2-Nsy-pro2000与NsyGCN2-pro相似度高达98.9%（数据未显示）。系统进化分析结果发现烟草GCN2启动子在进化上分为两种类型，其中NtGCN2-Nsy-pro2000、弱毒烟草NatGCN2-pro（N. attenuata）、白肋烟TN90GCN2-X3-pro（N. tabacum TN90 X3）与林烟草NsyGCN2-pro（N. sylvestris）在进化上亲缘关系较近。白肋烟TN90GCN2-pro（N. tabacum TN90）与绒毛状烟草NtoGCN2-pro（N. tomentosiformis）在进化上亲缘关系较近（图2）。这些结果表明NtGCN2-Nsypro2000在进化上可能来自林烟草。

图2 不同品种烟草GCN2启动子的系统进化分析Fig.2 The phylogenetic analysis of the GCN2 promoter from different tobacco varieties

2.2 NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS的遗传转化

采用农杆菌介导的方法进行遗传转化，结果如图3所示。未侵染菌液的K326叶片在含有卡那霉素的分化培养基上逐渐发白死亡（图3A），而在不含卡那霉素的分化培养基上正常分化（图3B），NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS转基因叶片分化出不定芽（图3C），将其移至生根培养基上培养，获得转基因植株（图3D）。

图3 NtGCN2-Nsy-pro2000遗传转化Fig.3 Genetic transformation of NtGCN2-Nsy-pro2000

2.3 转基因株系筛选与鉴定

2.3.1 组织化学染色分析

对获得的转基因株系进行GUS化学染色，结果如图4所示。其中，CaMV35S启动子转基因植株和NtGCN2-Nsy-pro2000启动子转基因植株叶片均被染上蓝色。该结果初步表明NtGCN2-Nsy-pro2000具有启动子活性，并在叶片中表达量最高，该结果与拟南芥和烟草中的基因表达结果相一致[4,12]。

图4 转基因烟草幼苗的GUS组织化学染色Fig.4 The GUS staining of transgenic tobacco seedlings

2.3.2 PCR鉴定

以提取转基因烟草植株的DNA为模板，采用GUS-F/R引物进行DNA鉴定，结果如图5所示。其中，以质粒为模板的阳性对照扩增出250 bp左右的条带，而以提取的K326植株DNA为模板的阴性对照未扩增出条带，NtGCN2-Nsy-pro2000转基因株系扩增产物与阳性对照扩增产物大小一致。该结果说明pCAMBIA-NPT-NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS载体成功整合至烟草K326的基因组中。

图5 转基因烟草的DNA-PCR鉴定Fig.5 DNA-PCR identification of transgenic tobacco

2.4 不同植物激素处理下NtGCN2-Nsy-pro2000启动子表达分析

采用SA处理NtGCN2-Nsy-pro2000启动子转基因幼苗后，转基因植株GUS基因表达和酶活测定结果如图6A所示。结果表明，SA处理后，GUS表达量和酶活性均呈现出先增加后降低的趋势。其中，SA处理24 h后，GUS表达量和酶活性最高。GUS基因表达量结果表明，SA处理24 h和48 h后GUS基因表达量显著高于0 h。GUS酶活性分析发现，SA处理24 h后GUS酶活性提高，48 h后下降。这些结果表明SA处理24 h激活GCN2-Nsy-pro2000启动子的表达。

MeJA处理NtGCN2-Nsy-pro2000转基因幼苗后，转基因植株GUS基因表达和酶活性分析如图6B所示。结果表明，MeJA处理后GUS基因表达和酶活性呈下降趋势。MeJA处理24 h和48 h后，GUS表达量与0 h相比显著下降。GUS酶活性测定结果表明，在处理24 h和48 h后，GUS酶活性显著下降，与GUS基因表达结果一致。这些结果表明MeJA抑制GCN2-Nsy-pro2000启动子的表达。

ABA处理NtGCN2-Nsy-pro2000转基因幼苗后，转基因植株GUS基因表达和酶活性分析如图6C所示。结果表明，ABA处理后，GUS基因表达量呈上升趋势而GUS酶活性呈先上升后下降趋势。ABA处理24 h和48 h后，GUS基因表达量持续增加。GUS酶活性测定在ABA处理24 h后显著增加，处理48 h后显著低于对照0 h。这些结果表明ABA处理可以激活GCN2-Nsy-pro2000启动子的表达活性。

AZA处理NtGCN2-Nsy-pro2000转基因幼苗后，GUS基因定量表达和酶活性分析结果如图6D所示。结果表明，AZA处理后GUS基因表达量呈上升趋势而酶活性呈先下降后上升趋势。处理48 h后GUS基因表达量是0 h的3.27（±0.05）倍，GUS酶活性是0 h的1.14（±0.02）倍。这些结果表明，NtGCN2-Nsy-pro2000启动子的表达活性在AZA处理48 h达到最大。

3 讨论

在植物中，GCN2广泛参与了多种生物和非生物胁迫应答[3-4]。此外，GCN2也可以被多种植物激素（SA、MeJA、AZA等）所激活[3-4,12]。本研究克隆了烟草NtGCN2基因启动子，发现启动子中存在众多胁迫应答元件，分析了不同植物激素处理下NtGCN2基因启动子的表达。

图6 SA、MeJA、ABA及AZA处理对转基因株系GUS基因表达量和酶活性的影响Fig.6 Effects of SA, MeJA , ABA and AZA treatments on the expression and enzymatic activity of GUSin transgenic lines

启动子通常位于基因上游，包含典型的核心启动子区和调控区，是基因表达的重要调控元件。本研究克隆的NtGCN2-Nsy-pro2000启动子有典型的高等植物启动子结构特点，调控区域存在诸多顺式作用元件，如干旱诱导元件（MBS）、脱落酸应答元件（ABRE）、茉莉酸甲酯应答元件（TGACG-motif）、乙烯应答元件（ERE）、光响应元件（AE-box）、厌氧诱导应答元件（ARE）以及参与防御和胁迫应答元件（TCrich repeasts）。在拟南芥和烟草中，GCN2可以响应干旱和冷害等非生物胁迫应答，同时也参与了SA、ABA、MeJA和AZA等植物激素应答[3,12]，这可能与NtGCN2-Nsy-pro2000启动子上含有众多顺式作用元件有关。

在烟草中，本实验室前期研究发现NtGCN2基因存在两个拷贝NtGCN2-1和NtGCN2-2，二者分别来自于其亲本林烟草和绒毛状烟草[4,10]。本实验克隆了NtGCN2-1基因上游2000 bp的启动子NtGCN2-Nsypro2000，系统进化分析发现该启动子序列与林烟草启动子序列相似度高达98.9%，这与NtGCN2-1在进化上来源于林烟草的结论一致[4,10]。

在烟草和拟南芥中，GCN2基因在根、茎、叶和花中均有表达[4,12]。烟草中，叶片中GCN2-1基因表达量最高，花茎次之，根中最低。本研究发现NtGCN2-Nsy-pro2000转基因株系幼苗的叶片中GUS染色最深，而在根和茎中未发现蓝色。该结果与NtGCN2在烟草中基因表达量结果相一致[4,12]。另外，尽管在根中未检测到染色，但基因表达结果表明其在根中有相对较低的表达。同时，拟南芥AtGCN2在根、茎、叶、花和角果中均有表达[4]，因此推测该启动子可能不具有组织特异性。

GCN2在动物和芽殖酵母中能够被氨基酸等营养缺乏激活，进而磷酸化eIF2α调节蛋白合成以应对胁迫和维持生存。GCN2在植物逆境胁迫中起重要作用。拟南芥和烟草中，GCN2广泛参与了各种生物和非生物胁迫（植物激素、干旱、低温、盐害和病虫害等）应答[12,14,31]。本研究中，NtGCN2-Nsy-pro2000启动子序列分析发现其上含有包括茉莉酸甲酯和脱落酸等植物激素应答元件在内的诸多顺式作用元件。植物激素ABA在植物抗逆中起重要作用，当植物受到干旱和盐胁迫时，植物体内ABA迅速积累以响应逆境[32]。在拟南芥和烟草中，GCN2能被ABA激活[10-11]。本研究发现NtGCN2-Nsy-pro2000序列上存在一个ABA应答元件（-1292 bp～-1298 bp），ABA处理激活了NtGCN2-Nsy-pro2000驱动的GUS基因表达。因此，推测ABA可能通过与启动子中ABA应答元件相互作用激活了GCN2的表达。茉莉酸甲酯可诱导激活植物防御机制，外源茉莉酸甲酯可激活植物对干旱、低温和盐胁迫等逆境的响应[33-35]。本研究结果发现NtGCN2-Nsy-pro2000上含有两个MeJA应答元件（-131 bp～-135 bp，-840 bp～-844 bp），MeJA激素处理结果表明MeJA抑制了NtGCN2-Nsy-pro2000启动子活性，该结果与实验室前期研究发现MeJA处理抑制了NtGCN2基因表达的结论相一致[12]。水杨酸是一种天然的植物激素信号分子，大量研究表明一定浓度的外源SA可以减轻盐胁迫对植物造成的危害[36-41]。在拟南芥和烟草中，SA处理激活了GCN2基因的表达[12,14]。本研究发现虽然NtGCN2-Nsy-pro2000启动子上未预测到SA应答元件，但是SA处理24 h激活了NtGCN2-Nsy-pro2000启动子驱动的GUS基因表达。该结果与拟南芥、烟草中SA激活GCN2基因表达的结果相一致。AZA是激活植物防御基因表达的诱导剂，在系统获得性抗性防御中起诱导作用[42]。在拟南芥和烟草中，AZA处理均激活了GCN2基因的表达，这与本研究中AZA处理48 h激活NtGCN2-Nsy-pro2000启动子驱动的GUS基因表达的结果相一致[12,14]。虽然在NtGCN2-Nsy-pro2000序列上未发现AZA和SA应答元件，但是SA和AZA处理后GCN2基因和NtGCN2-Nsy-pro2000启动子驱动GUS基因均被激活，说明NtGCN2-Nsy-pro2000启动子上可能存在着未预测到的SA和AZA应答元件，或者存在其它未知的调控机制。此外，缺失突变分析发现玉米亚硫酸氧化酶基因（ZmSO）启动子上含有的119 bp DNA元件能被ABA和干旱激活[43]；柑橘CsLCYb1（Lycopene β-cyclase）基因启动子含有的增强子元件可区分不同的柑橘种类[44]；小麦TaSnRK2（sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2）基因启动子TaSnRK2.8区域存在着茎特异性元件（-1481～-821）、叶特异性元件和根特异性元件（-2631～-1481 之间）[45]。因此，研究将进一步对NtGCN2-Nsy-pro2000启动子进行5’端缺失突变分析，明确其顺式作用元件的功能，为GCN2启动子调控研究奠定基础。

4 结论

本研究克隆了NtGCN2上游2000 bp序列，构建了NtGCN2-Nsy-pro2000::GUS启动子表达载体，并获得了启动子转基因株系。分析了NtGCN2-Nsypro2000启动子在四种植物激素胁迫下的表达，初步探究NtGCN2-Nsy-pro2000启动子的功能，得出以下结论：（1）克隆的NtGCN2上游2000 bp基因序列具有启动子活性，在进化上可能来源于其亲本林烟草。（2）NtGCN2-Nsy-pro2000驱动的GUS基因表达在四种激素处理下有不同的响应模式，AZA、ABA和SA激活NtGCN2-Nsy-pro2000启动子驱动的GUS基因表达，而MeJA抑制了NtGCN2-Nsy-pro2000启动子驱动的GUS基因表达。本研究从启动子入手探究了GCN2的表达模式，为GCN2调控机理的研究奠定了基础。