长期定位不同施肥类型对烟田土壤nifH细菌群落结构的影响

蒋雨洲，陈顺辉，李文卿*，刘青丽，李志宏，张云贵，张燕，唐英琪

1 黑龙江八一农垦大学，大庆 163391；

2 福建省烟草专卖局烟草科学研究所，福州 350013；

3 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081

生物固氮在农业可持续发展、环境保护和建立氮素生态平衡方面具有重要作用[1]。在陆地生态系统中，每年由微生物介导的固氮量平均达90～130 Tg[2]。施肥年限、施肥类型和土壤本质等因素，都会对土壤微生物活性、生物量和群落结构产生不同影响，最终表现为对农田有害、有益和无影响的结果[3]。因此，研究土壤固氮微生物其群落结构及其与施肥的关系，对于认识土壤氮素循环过程具有重要的意义。

固氮微生物是土壤生态系统中十分重要的功能群之一，其数量和种群结构的变化，直接影响着土壤固氮效率高低和土壤氮素循环的运转[4]。固氮微生物中广泛存在编码固氮酶含铁蛋白的nifH基因，与生物固氮过程有着紧密的联系[5-6]。Wakelin等[7]研究表明玉米秸秆回田可以显著增加含nifH基因细菌的丰度，而氮肥的施用不会对其产生显著影响；而刘朴方[8]认为，氮肥用量的增加会导致nifH基因丰度的降低，并影响含nifH基因细菌的群落结构。Teng QH等[9]证实低量有机肥导致玉米土壤含nifH基因细菌多样性增加。

稻草回田和饼肥施用是南方烟-稻轮作烟区的常用土壤保育措施，对提高土壤质量，保障烤烟生产的可持续发展具有重要意义。目前，有关施肥对土壤含nifH基因微生物群落影响的研究，主要集中在单一的施肥措施对微生物群落丰度、组成和多样性的影响，而长期定位施用饼肥和稻草回田对烟田土壤中含nifH基因微生物群落丰度、组成和多样性的影响，土壤中含nifH基因细菌的多样性与无机氮含量之间的关系方面尚未见报道。本文主要通过研究土壤无机氮含量与硝化细菌种群和固氮细菌种群的偶联关系，揭示农业生产中施用饼肥和稻草回田对烟田土壤无机氮含量及nifH细菌多样性的影响，旨在为烟田建立科学的施肥制度，提高土壤质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点和品种

试验在福州市晋安区宦溪镇福建省烟草科学研究所科研基地进行。2008 年水稻收割后试验田 0～20 cm耕层土壤基本养分较为一致，养分含量分别为：有机质 28.96 g/kg，碱解氮 144.66 mg/kg，速效磷 5.85 mg/kg，速效钾 142.43 mg/kg，pH 5.76。土壤类型为沙壤土。2009 年开始进行定位施肥处理。供试烤烟品种为翠碧 1 号。

1.2 试验设计

试验从 2009 年烤烟生产季开始，2008年水稻收割后将田块分成 3 个小区，每个小区 350 m2。试验共设置3 个处理，分别为：T1：常规施用化肥对照处理，每年水稻收割后将稻草清除出田；T2：常规施用化肥+稻草回田处理，在 T1 处理施肥的基础上，每年水稻收割后，将稻草粉碎后回田处理；T3：常规施用化肥+稻草回田+饼肥处理， 在 T2 处理的基础上，移栽前施条沟肥时增加施用饼肥 300 kg/hm2。各处理均不设重复。

1.3 田间管理

各处理每年晚稻收割后均进行溶田。每个处理2009—2013年烤烟生产季施用90 kg/hm2。化肥氮，N：P2O5：K2O＝1：0.75：2.63；2014—2017年 烤烟生产季施用97.5 kg/hm2化肥氮，N：P2O5：K2O＝1：0.75：2.63；（肥料分别为烟草专用肥N：P2O5：K2O＝12：8：22，复 合 肥N：P2O5：K2O＝15：15：15；硝酸钾N：P2O5：K2O＝13：0：38和硫酸钾含K2O 51%）；基肥：追肥=60：40。试验当季施用饼肥全氮含量3.91%，全磷含量10.7 g/kg，全钾含量11.92 g/kg；稻草全氮含量8.55 g/kg，全磷含量1.55 g/kg，全钾含量15.36 g/kg。每年水稻季N用量为96.3 kg/hm2，P2O5用量为70.5 kg/hm2的和K2O用量为26.25 kg/hm2，肥料种类分别为碳铵、过钙（有效磷≥12%）、复合肥（N：P2O5：K2O＝15：15：15）和水稻专用肥（N：P2O5：K2O＝12：6：7）。

1.4 样品采集

1.4.1 土壤理化性质测定样品采集

2017 年烤烟施肥移栽前，各小区按梅花 5 点取0～20 cm 耕层土壤混合样，剔除杂质后过 5 mm 筛，风干待测定土壤常规理化性质。6 月 30 日烟叶采收结束后每处理距离烟株 15 cm 处取 3 个烟畦纵切面土壤（2 cm 厚度）混合样， 风干后测定化学成分。

1.4.2 土壤细菌多样性测定样品采集

在 2017 年 6 月 15 日，烤烟收获季，取烟株根际土壤，每个处理小区各取样 3 次重复，剔除杂质后并过 2 mm 筛，装于封口袋冷冻保存，进行功能基因多样性分析。

1.5 样品的测定

土壤理化性质测定：土壤NO3--N含量和NH4+-N含量采用0.01 mol/L无水氯化钙浸提，德国默克公司生产的Reflectoquant试剂盒测定。

土壤细菌DNA提取，PCR扩增和Miseq测序：采集的土壤样品送至北京奥维森基因科技有限公司利用Illumina Miseq PE300平台进行测序分析。采用PowerSoil®DNA Isolation kit (MO BIO Laboratories,Inc., CA, USA）试剂盒，按操作步骤说明提取土壤DNA。用1%琼脂糖凝胶进行检测DNA提取质量和浓度。以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带8-bp Barcode的特异引物，进行PCR反应。nifH上游引物为AAA GGY GGW ATC GGY AAR TCC ACC AC，nifH下游引物为TTG TTS GCS GCR TAC ATS GCC ATC AT。PCR扩增程序：94℃预变性5 min后，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，循环32次，循环结束后72℃保持7 min，4℃条件下结束，收集数据。将同一样本3次PCR反应产物的混合物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测，QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）定量检测，最后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。混合后的样品进行Miseq测序，测序数据已上传至NCBI SRA数据库（SRA accession: PRJNA542599）。测定样品时，标准品与未知样品同时进行PCR循环，PCR反应体系配置如下：2×Taq Plus Master Mix 10 μL，10 mmol/L上游引物和下游引物各0.5 μL，加水至18 μL。加入2 μL DNA后，按以下程序进行PCR：95℃，30 s；40个PCR循环（95℃，5 s；60℃，40 s（收集荧光））结合标准曲线计算获得待测样品中nifH基因拷贝数。

1.6 计算方法和数据分析

生物信息学分析等由北京奥维森基因科技有限公司完成，原始数据下机后，首先进行数据质控，通过序列拼接、过滤和去嵌合体后得到优化序列，然后进行OTU聚类及注释，其中OTU划分基于核苷酸序列97%相似性水平。

不同处理对土壤nifH基因拷贝数、Alpha多样性的影响采用SAS package 9.1（SAS Institute，Cary，NC，USA）进行ANOVA分析，LSD（P＜0.05）进行差异比较；进化发生树通过MAFFT进行序列对齐，FastTree进行建树，并根据R语言把其物种的丰度和进化关系进行可视化展示；Venn图通过R语言工具统计和作图。

试验数据经 EXCEL 2010 整理后作图，并用SPSS 11.5 软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 长期定位施肥对土壤无机氮的影响

由图 1 可见，经过连续 8 年的定位施肥的试验地，烤烟采收后常规施用化肥的土壤T1处理和施用化肥+稻草回田的土壤T2处理的无机氮含量均高于移栽前土壤，而施用化肥+稻草回田+饼肥的土壤T3处理则反之；3 个处理烤烟移栽前和采收后的土壤无机氮含量，均以T3处理最高，分别为46.6 mg/kg和25.5 mg/kg，与同时期T1和T2处理间均呈显著性差异，但在移栽前T2处理的土壤无机氮含量高于T1处理，两处理间无显著性差异，而采收后T2低于T1处理土壤无机氮含量，两处理间无显著性差异。说明在稻草回田基础上再添加饼肥，能够提高烟田土壤无机氮含量。

图1 不同施肥处理烟田土壤无机氮含量Fig.1 Inorganic nitrogen contents in tobacco planting soil treated with different fertilization scheme

2.2 长期定位施肥对烟田土壤含nifH基因细菌α多样性的影响

如图 2所示，与长期单一施化肥的 T1 处理相比，稻草回田 T2 处理降低了烟田土壤中chao1指数，而增加饼肥的 T3 处理提高了烟田土壤中chao1指数，各处理间均无显著性差异。各处理的PD_whole_tree指数变化规律与chao1指数较为相似，T3处理最高，其次是T1 处理，而T2 处理最低。说明在稻草回田基础上增施饼肥有利于提高烟田土壤细菌的丰富度和谱系多样性。与长期单一施化肥的 T1 处理相比，稻草回田 T2 处理能够提高烟田土壤中shanoon指数，而再增施饼肥的 T3 处理可进一步提高烟田土壤中shanoon指数， T3 处理分别与T1和T2处理间呈显著性差异。从observed_species来看，各处理实际观测到OTU的个数变化规律与shanoon指数相似，T3处理最高，其次是T2处理，而T1 处理最低。说明在稻草回田基础上增施饼肥有利于提高烟田土壤细菌多样性。

2.3 长期定位施肥对烟田土壤中含nifH基因细菌群落结构的影响

如图 3 可知，3 个处理共测得 2003 个 OTU。T1和 T3处理的共有 OTU 个数最多，为 100 个；其次是T2 和 T3 处理的共有 OTU 个数为99个，而T1 和T2 处理的共有 OTU 个数最少，为98个。T2 处理独有 OTU 个数最少，为 18 个；其次是T1 处理的独有OTU 个数为19个，而T3 处理的独有 OTU 个数最高，为34个。说明烟-稻轮作体系下，长期稻草回田后加施饼肥均对土壤独有细菌种类的影响较小。

2.4 不同施肥处理的土壤nifH细菌OTU差异

各处理的OTU差异反映在二维坐标图上，处理组成越相似，反映在PCA图中的距离越近。如图4所示，各处理的3次重复分布较为集中，处理间差异明显。其中PC1因子的影响达62.16%，PC2因子影响为18.62%，两者影响合计为80.78%。T1 处理位于横坐标-0.2附近，纵坐标0～0.1的区间内；T2处理位于横坐标-0.1～0和纵坐标-0.1以下的区间内；T3处理位于横坐标0.15～0.2和纵坐标0～0.1的区间内。从各处理所在区间距离来看，T1 处理与T3处理在横坐标（PC1影响因子）的距离最远，并且高于T1 处理与T2处理和T2处理与T3处理，均约为2倍；从PC2影响因子看T1处理和T3处理差异较小，均与T2处理有较大的差异。说明在试验不同施肥类型主处理影响因子下，T1与T3处理对含nifH基因细菌影响的差异较大，T2处理居于两者中间；在PC2影响因子（定位施肥时间）影响下，T2处理与T1和T3处理的差异逐渐增大。

图 2 不同施肥处理烟田土壤中细菌 α 多样性分析Fig.2 Bacterial α-diversity in tobacco field soil treated with different fertilization scheme

图3 不同施肥处理烟田土壤中含nifH 基因细菌OTU 数的Venn 图Fig.3 Venn of nifH bacteria OTUs in tobacco field soil treated by different fertilization

2.5 不同施肥处理的含nifh基因细菌进化分支图

图4 不同施肥处理的土壤nifH细菌OTU差异Fig.4 Difference in OTU of soil nifH bacteria under different fertilization scehme

如图 5 可知，不同施肥处理对烟田土壤细菌进化分支有着不同的影响，从门至属的分类级别由辐射的圆圈内至外，着色为黄色的无显著差异物种所占比例较高，与之相比各处理中体现各自差异的细菌类群较少。各处理中在进化分支图明显体现的细菌在门水平未出现，T1 处理在进化分支图明显体现的细菌在纲水平未出现；在目水平包括Gallionellales；在科水平包括Phyllobacteriaceae、Desulfohalobiaceae和Gallionellaceae等。T2处理在进化分支图明显体现的细菌在纲水平包括Alphaproteobacteria；在目水平包括Rhizobiales；在科水平包括Bradyrhizobiaceae和Oxalobacteraceae等。T3 处理在进化分支图明显体现的细菌在纲水平未出现；在目水平包括Caulobacterales；在科水平包括Caulobacteraceae和Chloroflexaceae等。从而说明，单施化肥的烟田和化肥＋稻草回田+增施饼肥处理的烟田细菌在纲水平未出现显著的优势种群，而化肥＋稻草回田处理的烟田细菌在纲、目、科属水平均有较多的优势种群。

图5 不同施肥处理的土壤含nifH基因细菌 LEf Se 进化分支图Fig.5 LEf Se of soil nifH bacteria under different fertilization scheme

2.6 长期定位施肥对烟田土壤中含nifH基因细菌组成的影响

试验的3个处理共鉴定出17个门、23个纲、55个目、97个科、175个属。从表1可见，所占比例较高（相对丰度＞0.5%）的5个菌门，依 次 分 别 为Proteobacteria＞Cyanobacteria＞Verrucomicrobia＞Actinobacteria＞Spirochaetes，分 别 介 于80.01%～82.36%、33.24%～4.36%、3.15%～3.58%、3.49%～4.72%和0.48%～1.08%之间，以Proteobacteria最高，介于80.01%～82.36%之间。T1处理Proteobacteria的相对丰度为80.21%，T3处理比T1处理减少了0.25%，T2处理比T1处理增加了2.68%，且显著高于其它两个处理。

所占比例较高（相对丰度＞0.5%）的7个菌纲，依次分别为Alphaproteobacteria＞Deltaproteobacteria＞Betaproteobacteria＞Gammaproteobacteria＞Opitutae＞Actinobacteria＞Spirochaetia，分 别 介 于32.16%～36.02%、26.62%～27.90%、12.93%～16.09%、4.86%～5.34%、3.15%～3.58%、3.49%～4.72%和0.48%～1.08%之间，主要的4个菌纲：Alphaproteobacteria的相对丰度T1处理为32.16%，显著低于其它两个处理，T2和T3处理分别比T1处理增加了12.00%和7.45%；Deltaproteobacteria的相对丰度T1处理为26.62%，T2和T3处理分别比T1处理增加了4.81%和3.92%，三个处理间差异不显著；Betaproteobacteria的相对丰度T1处理为16.09%，T2和T3处理分别比T1处理显著减少了18.19%和19.63%；Gammaproteobacteria的相对丰度T1处理为5.34%，T2和T3处理分别比T1处理减少了1.21%和9.01%，三个处理间差异不显著。

所占比例较高（相对丰度＞0.5%）的12个菌目，依 次 分 别 为Rhizobiales ＞ Desulfovibrionales ＞Gallionellales ＞ Desulfuromonadales＞ Rhodocyclales＞ Nostocales ＞ Opitutales ＞ Burkholderiales ＞Myxococcales ＞ Frankiales ＞ Desulfobacterales ＞Methylococcales， 分 别 介 于31.32%～35.29%、14.16%～14.95%、6.02%～9.46%、6.64%～7.30%、3.44%～4.01%、2.27%～3.37%、3.14%～3.58%、2.62%～3.39%、2.93%～3.22%、3.34%～4.51%、1.93%～2.03%和1.61%～1.95%之间，主要的4个菌目：Rhizobiales的相对丰度T1处理为31.32%，T2和T3处理分别比T1处理增加了12.67%和7.74%，差异达到显著水平；Desulfovibrionales的相对丰度T1处理为14.16%，T2和T3处理分别比T1处理增加了5.54%和0.77%，处理间差异不显著；Gallionellales的相对丰度T1处理为9.46%，T2和T3处理分别比T1处理减少了26.37%和36.30%，降幅达到显著水平；Desulfuromonadales的相对丰度T1处理为6.64%，T2和T3处理分别比T1处理增加了8.49%和10.03%，处理间差异不显著。

所占比例较高（相对丰度＞0.5%）的12个菌科，依次分别为Bradyrhizobiaceae ＞ Desulfovibrionaceae＞ Gallionellaceae ＞ Geobacteraceae ＞ Rhodocyclaceae＞ Opitutaceae ＞ Nostocaceae ＞ Anaeromyxobacteraceae＞ Frankiaceae ＞ Methylococcaceae ＞ Methylocystaceae＞ Desulfobulbaceae，分 别 介 于28.12%～31.68%、13.18%～14.18%、6.02%～9.46%、6.37%～7.12%、3.44%～4.01%、3.14%～3.58%、1.97%～2.95%、2.92%～3.20%、3.34%～4.51%、1.61%～1.95%、1.60%～2.07%和1.22%～1.33%之 间，主 要 的4个菌科：Bradyrhizobiaceae的相对丰度T1处理为28.12%，T2和T3处理分别比T1处理增加了12.66%和7.70%，T1处理和T2处理差异达到显著水平；Desulfovibrionaceae的相对丰度T1处理为13.18%，T2和T3处理分别比T1处理增加了7.63%和3.20%，处理间差异不显著；Gallionellaceae的相对丰度T1处理为9.46%，T2和T3处理分别比T1处理减少了26.37%和36.30%，降幅达到显著水平；Geobacteraceae的相对丰度T1处理为6.37%，T2和T3处理分别比T1处理增加了9.38%和11.87%，三者差异不显著。

所占比例较高（相对丰度＞0.5%）的14个菌属，依次分别为Bradyrhizobium ＞ Desulfovibrio＞ Sideroxydans ＞ Geobacter＞ Anaeromyxobacter＞ Frankia ＞ Azospira ＞ Nostoc ＞ Methylocystis＞ Azoarcus ＞ Desulfobulbus ＞ Spirochaeta ＞Pseudacidovorax ＞ Methylococcus， 分 别 介 于27.96%～31.56%、13.18%～14.18%、6.02%～9.46%、6.37%～7.12%、2.92%～3.20%、3.34%～4.51%、1.30%～1.82%、0.66%～1.84%、1.60%～2.07%、1.50%～1.58%、1.08%～1.22%、0.45%～1.-03%、0.68%～1.03%和0.97%～1.10%之间，主要的4个菌属：Bradyrhizobium的相对丰度T1处理为27.96%，T2和T3处理分别比T1处理增加了12.88%和7.62%，T2处理和T1处理间差异达到显著水平；Desulfovibrio的相对丰度T1处理为13.18%，T2和T3处理分别比T1处理增加了7.63%和3.20%，处理间差异不显著；Sideroxydans的相对丰度T1处理为9.46%，T2和T3处理分别比T1处理减少了26.37%和36.30%，降幅达到显著水平；Geobacter的相对丰度T1处理为6.37%，T2和T3处理分别比T1处理增加了9.38%和11.87%，处理间差异不显著。属水平的细菌丰度在1%以上的有10个，分别 为Bradyrhizobium、Desulfovibrio、Sideroxydans、Geobacter、Anaeromyxobacter、Frankia、Azospira、Methylocystis、Azoarcus和Desulfobulbus。

表1 不同施肥处理对烟田土壤中含nifH基因细菌的组成与土壤无机氮含量Pearson相关性分析Tab. 1 Pearson correlation between relative abundance of nifH bacteria and inorganic nitrogen contents uin tobacco planting soil treated different fertilization scheme

续表1

2.7 相关性分析

表1所示，烟田土壤中含nifH基因细菌组成与土壤无机氮Pearson相关性分析，土壤中细菌门水平组成中Verrucomicrobia 和Acidobacteria相对丰度均与土壤无机氮呈极显著正相关；土壤中细菌门水平组成中Proteobacteria和Spirochaetes相对丰度分别与土壤无机氮呈显著负相关。土壤中细菌纲水平组成中Opitutae和Actinobacteria相对丰度均与土壤无机氮呈极显著正相关；土壤中细菌纲水平 组 成 中Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Spirochaetia相对丰度，均与土壤无机氮呈负相关，其中Gammaproteobacteria相对丰度与土壤无机氮呈极显著负相关，Spirochaetia相对丰度与土壤无机氮呈显著负相关。土壤中细菌目水平组成中Desulfovibrionales和Gallionellales相对丰度，均与土壤无机氮呈显著负相关；土壤中细菌目水平组成中Opitutales、Burkholderiales、Myxococcales、Frankiales和Methylococcales相对丰度，均与土壤无机氮呈极显著正相关，Desulfobacterales相对丰度与土壤无机氮呈显著正相关。土壤中细菌科水平组成中Gallionellaceae、Methylocystaceae和Desulfobulbaceae相对丰度，均与土壤无机氮呈显著负相关；土壤中细菌科水平组成中Opitutaceae、Anaeromyxobacteraceae、Frankiaceae和Methylococcaceae相对丰度，均与土壤无机氮呈极显著正相关。土壤中细菌属水平组成中Sideroxydans、zospira、Nostoc、Methylocystis、Desulfobulbus、Spirochaeta和Methylococcus相对丰度均与土壤无机氮呈显著负相关，土壤中细菌属水平组成中Anaeromyxobacter和Frankia相对丰度，均与土壤无机氮呈极显著正相关。

3 讨论

土壤微生物在土壤中参与有机质和各种养分的分解与转化，与土壤肥力高低密切相关，而土壤细菌是土壤微生物的主要组成部分[10-11]。长期施用饼肥并覆盖稻草，可有效增加土壤养分有效性[12]。本试验结果表明，长期稻草回田并施用饼肥有利于提高烤烟土壤无机氮含量；而单独稻草回田可能因稻草碳/氮比较高，回田后在土壤中分解过程中还消耗土壤中的氮，导致烟叶采收结束时土壤无机氮含量较低。

蒋雨洲等[13]研究结果表明在东北黑土的长期定位试验条件下，土壤微生物多样性受施肥类型的影响，与施加有机肥处理相比，单施化肥处理的土壤微生物多样性略低。从本研究的各处理独有OTU个数看，T3处理最高，为34个，而T1和T2处理分别为18和19个。由于土壤细菌群落结构易受有机肥料的影响，烟田施入有机肥导致土壤理化性质和微生物活性改变，从而改变了微生物群落多样性[14-15]。近年来，丁建莉等[16]研究结果表明在东北黑土的长期定位试验条件下，土壤微生物多样性受施肥类型的影响，施用有机肥比单施化肥的土壤微生物多样性较高。本研究结果发现与施用化肥农田相比，增施饼肥对聚类影响较大，与前人研究结果一致。

生物固氮是指在固氮微生物的作用下将空气中的氮气还原成氨的过程，是大气氮素进入生态系统物质循环的主要途径之一，土壤中古菌和细菌等多种类群都有固氮能力[17]。有研究表明，氮肥和有机肥施用影响土壤固氮微生物的群落组成[18-19]。有研究指出，施肥不会引起固氮微生物群落结构的显著变化[20]。从本研究细菌nifH基因α多样性看，在稻草回田基础上并添加饼肥有利于提高烟田土壤细菌丰富度和谱系多样性，这与TIAN等[21]研究结果较为一致。可能是因为有机物料还田为微生物代谢提供更多可供分解的植物残体，进而促进了土壤微生物活性，而且有机肥物料本身也带入大量活的微生物，所以增加了土壤微生物的丰富性[22]，但还需进一步深入探究。本研究结果发现与单施化肥相比，稻草回田处理和稻草回田配施饼肥处理，烟田土壤含nifH基因细菌α 多样性均有提高，而稻草回田配施饼肥处理最有利于提高烟田土壤中shanoon指数和实测的OTU个数。由于稻草回田增加了土壤有机质和有效养分含量[23-24]，能为固氮微生物特别是异养固氮微生物的生长和代谢提供物质和能量来源，从而有益于固氮微生物的繁殖[25-26]，而稻草回田后并配施饼肥，能进一步提供丰富的碳源及其他营养元素，进而促进土壤固氮微生物的大量繁殖[27-28]，而单一施肥会导致微生物多样性降低[29]，Zhou等[30]研究长期单施化肥对细菌群落结构的影响指出，单施化肥会减少细菌种群的丰度，而化肥与有机肥或绿肥秸秆长期配合施用，可改良土壤结构，增加土壤微生物的数量[31]。

Roesch等[32]研究证实农田土壤细菌多样性主要为丰度最高的Proteobacteria菌属，而本研究结果与之较为一致，但与前人研究所涉及细菌群落结构和丰度相比较，本研究所针对的微生物组成中，不同的菌种与土壤化学性质有着密切的关系，土壤中细菌丰富度受有机质含量的影响[33]，Proteobacteria（变形菌门）与土壤速效养分关系密切[34]，这可能稻草回田过程中稻草未彻底腐烂，在烟株生长期间继续分解的过程中仍然消耗一定的土壤氮，稻草回田处理Proteobacteria的相对丰度最高，在烤烟移栽前，处理间土壤无机氮的含量与Proteobacteria的相对丰度表现较一致，与前人研究结果相似，但在烤烟采收后，土壤无机氮的含量与Proteobacteria的相对丰度表现相反，可能是由于采收后烤烟根系分泌物的影响所致[35]，其原因还需进一步探究。本研究进一步明确Cyanobacteria（蓝细菌）丰度次之，而且Cyanobacteria与腐殖质的形成密切相关[36]，由于腐殖质是土壤有机质重要组分之一，稻草回田及有机肥的投入都会增加土壤中有机质含量，从而提高土壤肥力[37]；Verrucomicrobia、Actinobacteria和Spirochaetes的相对丰度＞0.5%，Verrucomicrobia（疣微菌）是一种纤维素降解菌，有利于植物残体在土壤中的分解，提高土壤肥力[38]，因此，本研究中增施饼肥的T3处理Verrucomicrobia的相对丰度最高；Actinobacteria（放线菌）能够起到病害生物防治的作用，农田施肥可以向土壤中输入养分，刺激微生物生长繁殖，从而影响土壤微生物的丰度、活性、微生物量和微生物群落结构[39-40]，而农田施入有机肥还能够改良土壤理化性质，促进有益菌生长[41]，因此，本研究中随着有机肥量的增多呈现出Actinobacteria丰度较高的趋势。

本研究通过LEf Se进化分支图还发现，在烟田细菌目水平组间差异相比，各处理中单施化肥、稻草回田和增施饼肥的烟田细菌目水平组间差异较高的分别是Gallionellales（披毛菌目）、Rhizobiales（根瘤菌目）和Caulobacterales（柄杆菌目）有关目的物种。由于Gallionellales（披毛菌目）参与Fe的转化[41]，与固氮方面没有直接联系，而Rhizobiales（根瘤菌目）在土壤中长期以腐生菌的状态存在，起到固氮作用[42]， Caulobacterales（柄杆菌目）有利于物料的分解[43]，且能与根瘤菌协同作用，联合固氮，增强土壤生物固氮，从而提高土壤肥力[44]，而本研究中稻草回田后并配施饼肥的烟田，在烤烟移栽前和采收后的土壤无机氮含量均最高，与该理论一致。

4 结论

（1）不同施肥类型对植烟土壤无机氮含量有着不同的影响，稻草回田和稻草回田并添加饼肥能够改善植烟土壤无机氮含量，稻草回田并添加饼肥更有利于提高土壤无机氮含量。

（2）不同施肥类型对土壤nifH基因细菌的独有OTU 个数影响较小，但与单施化肥相比，稻草回田或再增加饼肥有利于提高α 多样性。

（3）不同施肥类型对植烟土壤微生物组成的影响，细菌所占比例较高的主要1个菌门，Proteobacteria，而Proteobacteria 菌门和菌门下物种的相对丰度最高，其中与单施化肥相比，稻草回田的植烟土壤 Proteobacteria 菌门相对丰度高。

（4）不同施肥类型对植烟土壤微生物 LEf Se 进化分支图有明显影响，单施化肥的烟田土壤细菌表现优势的细菌种群主要是Gallionellales（披毛菌目）及其目下的细菌种群；化肥＋稻草回田处理和化肥＋稻草回田＋饼肥处理的烟田土壤分别是Rhizobiales（根瘤菌目）和Caulobacterales（柄杆菌目）及其目下的细菌种群。