富氢水对草地早熟禾耐盐性的影响以及与抗氧化酶活性的关系

张韦钰， 王春勇， 杜红梅

(上海交通大学设计学院， 上海 200240)

草地早熟禾(Poapratensis)是禾本科早熟禾属多年生草本植物，喜欢湿润冷凉的气候，具有较强的抗寒能力，广泛地分布于我国东北、华北、西北以及西南等地[6-7]。不同草地早熟禾品种的耐盐性不同，‘Midnight II’是一个坪用性状好，耐热性强的草地早熟禾品种，适宜在我国华东地区栽培，但是耐盐性较差[8]。我国江淮一带有比较大的沿海滩涂面积，分析盐胁迫对草地早熟禾的影响，采用一定的措施提高草地早熟禾品种的耐盐性，并分析其机理对于草地早熟禾的推广具有重要意义。

氢气(H2)是宇宙中最轻、最充分的元素，一直以来被认为是一种惰性气体。但是近年来的研究表明，H2具有重要的生物学功能，可以提高植物对非生物胁迫的抗性[9]。现有的研究表明，H2可以提高拟南芥(Arabidopsisthaliana)[10]，甘薯(Dioscoreaesculenta)[11],水稻(Oryzasativa)[12-13],小白菜(Brassicacampestris)[14],玉米(Zeamays)幼苗[15]和黄瓜(Cucumissativus)幼苗[16]的耐盐性。H2提高植物的抗盐性和植物抗氧化能力的提高有关。赵苹艺等的研究表明，H2提高甘薯幼苗的抗盐性主要和幼苗中相对含水量(Relative water content,RWC)的增加和抗氧化能力的提高有关[11]；田婧芸等证明了富氢水(Hydrogen-rich water,HRW)通过避免盐胁迫下玉米幼苗的氧化应激及重建活性氧稳态来提高其耐盐性[15]；Xu等也证明了H2增强水稻幼苗的耐盐性和ROS代谢及其相关基因的表达有关[13]。在以往对草地早熟禾耐盐性影响的研究，多集中于不同品种耐盐性的评价[17]、转基因植株的研究[18]、外源添加物质[19-20]以及生长调节剂[21]对草地早熟禾耐盐性的影响等方面，而有关外源H2对草地早熟禾的耐盐性及相关机制的影响的研究尚未见报道。本研究在前期工作的基础上，在采用200 mM NaCl胁迫处理处理前以及胁迫处理前期，分别使用HRW对草地早熟禾进行叶片喷施和灌根处理。通过比较非盐处理以及盐处理条件下，HRW对草地早熟禾叶片中相关生理指标以及抗氧化酶相关基因表达等的影响，分析HRW对草地早熟禾耐盐性的影响，并从抗氧化胁迫的角度，初步阐述HRW处理影响草地早熟禾耐盐性的可能机制，本研究结果对草地早熟禾耐盐性的提高，以及氢农业的发展具有一定的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本次试验草种为从北京克劳沃种子公司购买的进口草地早熟禾品种‘Midnight II’。草种净度为98%，发芽率为95%。

1.2 方法

1.2.1富氢水的制备 参考Cui等的方法[22]，将使用SHC-300型氢气发生器(济南浩伟仪器有限公司)制得的纯净氢气(99.99%，v/v)以150 mL·min-1的速率通入1 L的去离子水中1 h，制得浓度为1.20 ppm的HRW。然后立即用去离子水进行稀释，制得体积浓度为50%的HRW。HRW浓度使用ENH-100便携式测氢仪(Trustlex Co.,Led,Japan)测定。

1.2.2试验处理 挑选大小一致，颗粒饱满的草地早熟禾种子，5%的次氯酸钠消毒15 min后，均匀地播种于4×8的穴盘中，每穴播种10粒种子，待穴盘种子萌发第二片叶后开始添加1/4的Hoagland’s营养液，35 d后开始进行HRW处理。分为4种处理，分别是处理I：对照(Control，去离子水)，即只进行去离子水的浇灌，不添加HRW与NaCl处理；处理II：50% HRW (去离子水+50% HRW)，使用50%的HRW对草地早熟禾进行叶片喷施和灌根，保证叶片的正反两面均匀喷施，灌根时充分灌溉，以有水从穴盘底部流出为准，平均每株的施用量为大约10 mL，连续处理2 d，每天处理1次；处理III：200 mM NaCl，为了防止产生“盐激”，NaCl浓度每天增加50 mM，至第4 d，达到200 mM；处理IV：200 mM NaCl+50% HRW，HRW在添加NaCl前2 d和前1 d各添加1次，添加NaCl 4 d后添加1次，添加方法同处理II及处理III。每个处理重复4次，每个处理16孔。盐胁迫处理的0 d，5 d，15 d和20 d取样进行盐胁迫指标和活性氧代谢相关指标分析。

4个组同时在人工气候室内进行培养，气候室内温度(23±2)℃/(18±2)℃(昼温/夜温)，相对湿度60%～80%，光周期10 h，光合有效辐射510 μmol·m-2·s-1。

1.2.4qRT-PCR 参照天根生化科技公司的RNAprep pure Plant Kit试剂盒进行草地早熟禾总RNA的提取，然后依照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒将RNA反转录成cDNA，以合成的cDNA为模板，以Actin作为内参基因，对草地早熟禾APX1，MR，CAT2基因进行扩增qRT-PCR按照TaKaRa公司的TB Green®Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus)试剂盒进行。参考转录组测序结果进行引物设计，引物序列详见表1。

表1 草地早熟禾抗氧化酶相关基因引物

1.3 数据分析

应用SPSS 22.0软件，在P<0.05的水平，采用Fisher’s最小显著差异法，分析HRW对盐胁迫条件下草地早熟禾耐盐相关生理指标、ROS积累、抗氧化酶活性以及抗氧化酶相关基因表达的影响。图采用SigmaPlot 13.0软件绘制。

2 结果与分析

2.1 富氢水处理对草地早熟禾抗盐相关生理指标的影响

盐胁迫显著增加了草地早熟禾叶片的DMC(P<0.05)。而50%的HRW处理抑制了盐胁迫条件下草地早熟禾叶片的DMC积累，尤其是在长时间盐胁迫条件下。在第5 d，10 d，15 d和20 d盐胁迫条件下，添加50%的HRW处理后，草地早熟禾叶片的DMC分别下降了4.50%，5.30%，17.02%和28.42%(图1-A)。

5 d～20 d的盐胁迫均显著降低了草地早熟禾叶片的RWC (P<0.05)。添加HRW抑制了盐胁迫导致的草地早熟禾叶片失水。与不添加HRW的盐胁迫处理相比，添加HRW处理10 d，15 d和20 d，草地早熟禾叶片的RWC分别增加了14.17%，35.54%和84.98%。而不加盐的条件下，添加HRW对草地早熟禾叶片的RWC没有显著影响(图1-B)。

图1 50%富氢水处理对盐胁迫条件下草地早熟禾叶片干物质含量(A)、相对含水量(B)的影响

与对照组相比，5 d和10 d盐胁迫条件下草地早熟禾叶片叶绿素含量无显著变化，第15 d和第20 d显著下降(P<0.05)。添加HRW延缓了由于盐胁迫处理导致的草地早熟禾叶片的叶绿素降解。第15 d和20 d盐胁迫条件下添加50%的HRW，草地早熟禾叶片中叶绿素含量显著增加(P<0.05)，分别提高了49.32%和65.20%(图2)。

图2 50%富氢水处理对盐胁迫条件下草地早熟禾叶片叶绿素含量的影响

盐胁迫显著增加了草地早熟禾叶片的EL值(P<0.05)。与对照组相比，随着盐害程度的加深，草地早熟禾叶片的EL值逐渐增加(图3)。50%的HRW处理显著降低了盐胁迫条件下草地早熟禾叶片的EL值增加。在盐处理的第5 d，10 d，15 d和20 d，添加50%HRW后，EL值分别下降了16.55%，18.24%，33.73%和25.08%。

图3 50%富氢水处理对200 mM NaCl处理条件下草地早熟禾叶片电解质外渗的影响

2.2 富氢水处理对盐胁迫下草地早熟禾活性氧代谢的影响

图4 50%富氢水处理对盐胁迫条件下草地早熟禾叶片超氧阴离子(A)和过氧化氢(B)含量的影响

MDA含量是衡量胁迫条件下植物细胞膜脂过氧化程度的重要指标。草地早熟禾叶片内的MDA含量随着盐胁迫时间的延长而增加，在盐胁迫的第5 d和20 d，相较于对照组，MDA含量分别增加了34.74%和122.51%；而外源添加HRW则显著降低了盐胁迫条件下草地早熟禾体内MDA的积累(P<0.05)，相较于NaCl处理组，在第5 d和第20 d，HRW+NaCl组中草地早熟禾体内的MDA含量分别降低了23.85%和26.22%(图5)。

图5 50%富氢水处理对盐胁迫条件下草地早熟禾叶片丙二醛含量的影响

盐胁迫显著增加了草地早熟禾叶片SOD活性(P<0.05)。而长时间盐胁迫条件下，添加HRW则显著降低了草地早熟禾叶片中SOD的活性(P<0.05) (图6-A)。盐胁迫显著增加了草地早熟禾叶片POD活性(P<0.05) (图6-B)。而外源添加50%浓度HRW，显著抑制了草地早熟禾叶片中POD活性的增加，与不添加HRW处理的盐处理相比，第5 d和20 d，POD活性分别降低了22.02%和23.30%。短时间的盐胁迫显著增加了草地早熟禾叶片CAT活性，而长时间的盐胁迫显著降低了草地早熟禾叶片CAT活性(P<0.05)。外源添加HRW抑制了长时间盐胁迫下CAT活性的降低，与NaCl处理组相比，HRW+NaCl处理组中的CAT活性提高了36.51%(P<0.05) (图6-C)。

图6 50%富氢水处理对盐胁迫条件下草地早熟禾叶片超氧化物歧化酶(A)、过氧化物酶(B)和过氧化氢酶(C)活性的影响

盐胁迫处理5 d没有显著影响草地早熟禾叶片APX活性。盐胁迫处理20 d后，APX活性显著下降(P<0.05)。外源添加HRW显著增加了20 d盐胁迫下草地早熟禾叶片中APX活性(图7-A)。5 d和20 d的盐胁迫显著增加了草地早熟禾叶片的GR活性，尤其是在20 d盐胁迫下。外源添加HRW显著降低了20 d盐胁迫下草地早熟禾叶片中GR的活性(图7-B)。5 d和20 d的盐胁迫显著降低了草地早熟禾叶片的DR活性。外源添加HRW显著提高了盐胁迫条件下草地早熟禾叶片中DR的活性，相较于盐胁迫组，DR活性分别提高34.12%和58.22%(如图7-C)。5 d盐胁迫条件下草地早熟禾叶片中的MR活性显著增加，而20 d盐胁迫条件下，草地早熟禾叶片中MR活性显著下降。添加HRW抑制了盐胁迫对草地早熟禾叶片MR活性的影响，20 d时差异达显著水平(P<0.05)，相较于NaCl处理组，HRW+NaCl处理组叶片中MR活性提高了52.93%(图7-D)。

图7 50%富氢水处理对盐胁迫条件下草地早熟禾叶片抗坏血酸过氧化物酶(A)、谷胱甘肽还原酶(B)、脱氢抗坏血酸还原酶(C)和单脱氢抗坏血酸还原酶(D)活性的影响

以草地早熟禾不添加NaCl和HRW对照条件下的基因表达量为1，对比其在5 d和20 d，50% HRW处理、200 mM NaCl处理以及200 mM NaCl+50%HRW处理条件下的抗氧化酶基因表达量，以此来分析HRW对盐胁迫条件下草地早熟禾抗氧化酶相关基因表达的影响。在5 d和20 d盐胁迫条件下，与对照相比，草地早熟禾叶片内3个抗氧化酶基因CAT2，APX1和MR均上调表达，外源施加50% HRW不同程度的降低了盐胁迫条件下相关基因的表达量(图8)。在盐胁迫的第5 d和20 d，草地早熟禾叶片中CAT2，APX1和MR的相对表达量分别是对照组的1.67倍和1.71倍，1.48倍和2.54倍以及2.38倍和1.79倍；而外源添加50%的HRW分别使盐胁迫下CAT2，APX1和MR的相对表达量降低了27.53%和24.56%，40.6%和35.21%以及21.73%和31.17%。

图8 50%富氢水处理对盐胁迫条件下草地早熟禾叶片CAT2 (A)，APX1 (B)和MR (C)相对表达量的影响

3 讨论与结论

采用一定的措施提高草坪草的耐盐性，并分析其相关机制，是草坪草应用和新品种选育过程中的难点。盐害影响植物的光合作用以及水分的吸收和利用[30]。草地早熟禾在盐胁迫，尤其是长时间盐胁迫条件下叶片的RWC含量下降，DMC含量增加，外源添加HRW处理后，盐胁迫下草地早熟禾叶片RWC含量上升，DMC含量下降，这可能是由于草地早熟禾在盐胁迫下，细胞失水导致RWC含量下降，DMC含量上升，而添加HRW降低了细胞的失水率，提高了细胞的RWC，也在一定程度上导致了DMC含量下降现象的发生。

盐胁迫条件下叶片衰老的重要原因是叶绿素含量下降[31]，叶绿素含量的高低与叶片的光合能力密切相关。盐胁迫条件下添加HRW，尤其是在15 d和20 d盐胁迫条件下，与NaCl处理组相比，HRW+NaCl处理组的叶绿素含量维持在较高水平，这说明HRW能够有效维持盐胁迫下草地早熟禾体内的叶绿素含量，维持植物光合作用的正常进行。细胞失水会引起细胞内膨压和渗透势的改变，造成电解质外渗率的增加[32]。植物在盐胁迫条件下会发生膜透性增强和膜脂过氧化现象。作为膜脂过氧化的产物，MDA会损害细胞生物膜并抑制保护酶的活性[33]。在本研究中，盐胁迫条件下，草地早熟禾叶片EL值上升，MDA含量增加，外源添加HRW降低了盐胁迫下叶片的EL，减少了叶片MDA的积累，这说明外源添加HRW降低了盐胁迫条件下草地早熟禾细胞膜的损伤。

高浓度的ROS对植物的生长是有害的。盐胁迫条件下，光合作用受到抑制，ROS的合成增加，植物体内的氧化还原过程失衡，引起氧化损伤，破坏植物体内的生物大分子[36]。此时，抗氧化酶活性提高，用于清除过量的ROS[31],和Puyang等的研究一致，在一定时间盐胁迫条件下，草地早熟禾ROS清除酶活性增加[34]。与盐处理的对照相比，HRW处理后ROS积累量显著下降，因此相关ROS清除酶的活性也显著低于仅用盐处理的植株。另外，和Xu等[13]在水稻盐胁迫以及Cui等[22]在苜蓿(Medicagosativa)镉胁迫中的发现一样，也发现了重度盐胁迫条件下，草地早熟禾中部分抗氧化酶，包括CAT，APX，DR和MR活性显著下降，而在HRW处理条件下，这些抗氧化酶的活性显著增加，从而有效降低盐胁迫损伤，减少细胞的过氧化程度，保护细胞膜的完整性。

植物盐胁迫条件下，通过相关酶基因的表达，诱导抗氧化酶蛋白的表达，从而使植物表现出一定的抗盐能力。在本研究中，在盐胁迫条件下，与0 d以及5 d和20 d非盐胁迫的对照相比，草地早熟禾抗氧化酶基因CAT2，APX1和MR都上调表达，可能是植物对于ROS积累的一种响应。Xie等[10]在盐处理5 d的拟南芥植株中发现了H2阻遏了由盐胁迫导致的cAPX1的下调表达，而Xu等[13]的研究也发现，水稻盐处理3 d，添加HRW有利于APXb和CATB基因的上调表达，提高相关抗氧化酶的活性，缓解水稻的盐胁迫。与前人的研究不同的是，添加HRW后，草地早熟禾3个抗氧化酶基因CAT2，APX1和MR的表达量都显著的低于盐胁迫处理，这一方面可能是由于受胁迫强度的影响，另一方面是由于添加HRW处理后，ROS含量显著下降，反馈调控了抗氧化酶基因的上调表达。

基于以上分析，并结合盐胁迫下草地早熟禾的各项生理指标可知，50% HRW处理能够有效提高草地早熟禾的耐盐性，缓解盐胁迫带来的氧化损伤，基于此推测在植物逆境胁迫中，HRW可能有直接清除ROS的能力，而这一观点已经在动物试验中得到了证实。Ohsawa等[37]以及Ohta[38]的研究均表明，H2可以选择性的清除生物体内的过量自由基，同时不会与其它必要的ROS发生反应，从而发挥其抗氧化的作用。此外，在体外试验中，也进一步证实了HRW有直接淬灭H2O2的作用[10]。与沈文飚等[9]的推测一样，本研究认为在H2调控草地早熟禾盐胁迫过程中，ROS的含量变化可能发挥关键作用。外源H2添加的情况下，草地早熟禾盐胁迫下ROS的重要作用可以总结为图9。

图9 活性氧在外源H2调控草地早熟禾耐盐性中的重要作用

综上所述，外源添加HRW显著提高草地早熟禾的耐盐性，可能与HRW通过降低ROS积累，维持细胞膜的稳定性，避免氧化应激，重构活性氧稳态，提高细胞的抗氧化能力有关。