草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3基因的克隆及表达分析

金一锋， 陈 阳， 齐 欣， 高岩松， 金忠民， 赵清峰， 王 琦

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院， 黑龙江 齐齐哈尔 161006； 2.抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室， 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

生态园林已成为我国现代城乡一体化建设的主要目标，草坪对改善城市生态环境，维护生态平衡有重要作用。草地早熟禾(PoapratensisL.)是优质的冷季型草坪草，广泛用于北方城市园林建设。氮素和干旱显著影响草坪草的观赏价值，草坪草在氮素供应不足或者干旱胁迫时，常呈现出黄化、低矮、抗逆能力差等现象[1]。在旱地生态系统中，硝态氮是植物生长发育的主要氮素来源，土壤干旱影响植物硝态氮的同化过程中氮素的吸收与利用，而未被植物吸收的硝态氮易淋移和挥发进入地表水、地下水及大气，对其造成污染[2-3]。因此，植物逆境胁迫下硝态氮吸收和转运过程受到许多研究者的关注。

硝酸根离子的吸收是植物硝态氮利用过程的第一步，其中硝酸盐转运蛋白(Nitrate transporter，NRT)在吸收和感知外界硝酸盐及信号调控方面有着重要的作用，因此硝酸盐转运蛋白是植物氮素营养系统的关键生物大分子之一。高等植物存在的硝酸盐转运蛋白包括：高亲和硝酸盐转运系统(HATS)，低亲和硝酸盐转运系统(LATS)，双亲和硝酸盐转运系统。高亲和硝酸盐转运蛋白主要由NRT2家族编码，而低亲和性硝酸根转运蛋白在外源硝态氮浓度较高时发挥作用，主要由NRT1/PTR FAMILY(NPF)家族编码[4-6]。对植物NPF的研究发现，它不仅是硝酸盐或肽转运体，部分NPF转运蛋白还可以运输不同的底物，如：硝酸盐/生长素、硝酸盐/脱落酸、硝酸盐/硫代葡萄糖苷或赤霉素/茉莉酸[7-8]。

有关于拟南芥和水稻的NPF家族基因的研究较为深入，很多基因的功能已被鉴定[9-18]。目前关于禾本科草坪草NPF家族基因的研究较少，克隆并鉴定草地早熟禾NRT1/PTRFAMILY家族基因的功能，有助于研究草地早熟禾硝酸盐转运过程，丰富草坪草硝酸盐转运机制相关研究。本研究克隆草地早熟禾NRT1/PTRFAMILY8.3基因，并对其进行理化性质、结构域、同源进化关系等生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR测定不同组织及不同氮素形态、氮素浓度、干旱胁迫下的基因表达水平，为进一步研究其功能奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理方法

试验于 2019年3-8月在齐齐哈尔大学生命科学与农林学院园林园艺遗传育种研究室进行，试验所用材料草地早熟禾为‘午夜2号’品种。试验材料置于光照培养箱内预培养 50 d以上，培养条件参数设置为：昼夜温度为25℃/15℃，光/暗为13 h/11 h，光照强度为400 μmol·m-2·s-1，相对湿度(65±5)%。

选取生长健康、长势一致的草地早熟禾幼苗，将其根部洗净后置于1/2 Hoagland水培液中，待培养14 d后进行氮素、干旱处理。具体处理分组为：(1)采用NaNO3(单一硝态氮)为氮源配置不同氮素浓度梯度的水培液处理植株，研究目标基因的表达情况，氮素浓度分别为0 mM (NN)，1.5 mM (LN)，7.5 mM (ON)，15 mM (HN)，每2 d更换1次培养液，14 d后取样;(2)采用硝态氮(NaNO3)、铵态氮((NH4)2SO4)、混合态氮(NH4NO3)水培液处理植株，14 d后取样，研究相同氮素水平时(N浓度为7.5 mM)不同氮素形态处理下目标基因的表达情况;(3)将10% PEG-6000 (Polyethylene glycol) 加入1/2 Hoagland营养液中，对植株进行模拟干旱处理，干旱诱导时间分别为：0 h，2 h，16 h;(4)采用1.5 mMNaNO3，15 mMNaNO3水培溶液处理14 d的植株，置于10% PEG-6000中，16 h后进行取样。以上处理植物的取材部位均为叶部，每个处理 3次生物学重复，置于-80℃保存。

1.2 草地早熟禾转录组测序

提取NN，LN，ON，HN 4个处理组的草地早熟禾植株叶片总RNA，送生工生物工程股份有限公司(上海)通过Illumina HiSeqTM2500平台进行RNA-Seq转录组测序。对于Trinity拼接得到的非冗余转录本，提取最长的转录本作为Unigene，作为后续分析的参考序列。

1.3 草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3基因克隆

利用植物总RNA提取试剂盒(TianGen，BeiJing)进行草地早熟禾叶片总RNA的提取。利用Nanodrop 2000检测RNA浓度与纯度，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。以草地早熟禾总RNA为模板，采用PrimeScriptTMII 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，Japan) 将提取的总RNA反转录成cDNA，用于NRT1/PTRFAMILY8.3基因克隆。根据转录组测序得到的草地早熟禾相关序列为基础，结合Genebank公布的二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)NRT1/PTRFAMILY8.3(XM_020332740.1)，设计特异性引物NRT1/PTRFAMILY8.3-F:5′-CCATTCCCCTC CCCCATG GCAT-3′,NRT1/PTRFAMILY8.3-R:5′-ATCCTGCTAGTTATTGTGTAATCTTTG-3′。以反转录的cDNA为模板进行扩增，94℃预变性5 min后，94℃变性2 min,退火56℃ 30 s,延伸72℃ 45 s，共32个循环，最终延伸72℃ 5 min，获得草地早熟禾NRT1/PTRFAMILY8.3基因ORF片段。引物的合成和测序由生工生物工程股份有限公司(上海)完成。

1.4 草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3基因生物信息学分析

利用NCBI中CDD工具进行蛋白保守结构功能域分析；利用DNAMAN进行氨基酸同源性比对分析；利用MEGA7.0构建系统进化树，相关蛋白的保守基序分析使用MEME(http://meme.sdsc.edu)进行；利用ProtParam分析NRT1/PTR FAMILY8.3蛋白的基本理化性质；利用SOPMA在线预测蛋白质二级结构，用SWISS-MODE预测蛋白质三级结构。

1.5 实时荧光定量PCR分析

分别提取同一氮源不同氮素浓度梯度、同一氮素水平不同氮源、及模拟干旱处理后草地早熟禾不同组织部位(根、茎、叶)的RNA，反转录成cDNA作为后续PCR扩增的模板。采用qRT-PCR的相对定量方法，参照TB GreenTMPremix Ex TaqTMII进行试验。qRT-PCR反应体系为50 μL，包含：4 μL cDNA，2 μL Q-NRT1/PTRFAMILY8.3-F(5′-ATGCCTCTGCAG GATCATGTG-3′),2 μL Q-NRT1/PTRFAMILY8.3-R(5′-GGCTCGCCGCCTCAACGTTG-3′)，17 μL ddH2O，25 μL TB Green Premix Ex Taq II。PCR反应条件为：95℃预变性 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，共45个循环。选择的内参基因为草地早熟禾UBQ，Q-UBQ-F:AGAAGAAGACCTACACCAAG，Q-UBQ-R:GGTTGTAAGGCGTAGGTGAG。该试验生物学重复3次，试验重复3次，利用2-ΔΔCt法处理数据。

2 结果与分析

2.1 草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3基因全长cDNA克隆

以草地早熟禾叶片cDNA为模板，Q-NRT1/PTRFAMILY8.3-F和Q-NRT1/PTRFAMILY8.3-R为特异性引物进行PCR扩增，获得一条大小为2 274 bp的特异条带(图1)，经测序将所得序列命名为NRT1/PTRFAMILY8.3。草地早熟禾NRT1/PTRFAMILY8.3基因序列全长2 274 bp，含1 260 bp的开放阅读框(ORF)，编码419个氨基酸(图2)。

图1 草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3基因的扩增产物

图2 草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3基因序列

2.2 草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3 编码蛋白序列分析

通过NCBI中CDD在线分析发现，草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3含有The Major Facilitator Superfamily(MFS)结构域，分别为在第30～232位含有233个氨基酸的MFS结构域和在第319～415位含有97个氨基酸的MFS结构域，它们均属于MFS超家族(图3)。利用ProtParam软件对草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3蛋白进行理化性质分析，经分析表明，草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3蛋白质分子式为C2056H3204N536O580S25，为稳定蛋白，分子量为45.51 kDa，理论等电点(pI)为7.5。该蛋白表面带负电荷氨基酸残基(Asp + Glu)、正电荷的氨基酸残基(Arg + Lys)分别有31个和32个，平均亲水系数为0.310。Protscale在线蛋白亲疏水性分析显示NRT1/PTR FAMILY 8.3属于亲水性蛋白，平均亲疏水系数为0.310，疏水性在第375位点最强，分值为2.689，亲水性在第27位点最强，分值为—2.553(图4)。

图3 草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3功能结构域

图4 草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3蛋白的亲水性分析

通过SOPMA软件对草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3蛋白进行二级结构预测，结果显示：草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3蛋白主要由α-螺旋(43.2%)和不规则卷曲(35.80%)组成，另加少量的延伸链(16.95%)和β-转角(4.06%)(图5)。该二级结构组成与进一步利用SWISS-MODEL三维建模的预测结果一致(图6)。

图5 草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3蛋白的二级结构

图6 草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3蛋白的三级结构

利用MEGA 7.0及MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)进行氨基酸比对，进一步了解不同物种中NRT1/PTR FAMILY 8.3氨基酸同源进化关系(图7)。草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3与二穗短柄草的NRT1/PTR FAMILY 8.3(XP_014757425.1) 同源性最高。由图7可知，多个禾本科植物(Gramineae)的NRT1/PTR FAMILY 8.3氨基酸序列汇集在一起，与棕榈科(Palmaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)植物NRT1/PTR FAMILY 8.3的亲缘距离较近，与豆科(Leguminosae)、蔷薇科(Rosaceae)较远。通过MEME保守域预测，发现众多物种的NRT1/PTR FAMILY 8.3氨基酸序列包含8个保守域序列：motifs-1，QDZDAGLYTGDGSVDIKGNPALKQNTGNWR ACPFILGTECCERLAYYGIA；motifs-2，TNLVT YLTKKLHZGNVSAARNVTTWQGTCYLTPLJ-GAVLADSYWGRYWTI；motifs-3，GLYLIALGT GGIKPCVSSFGADQFDDTDPAERVKKG SFFNWFYFSINIGA；motifs-4，JVWIQDNAGWGLGF GIPTLFMAJAIASFF；motifs-5，TPLYRFQKPGGSPLTRMCQWVAAFRKWNVDVPH-DSSLLYETP；motifs-6，ESAEGSRKLEHTDELKFLD KAATISSAD；motifs-7，NPWRLCTVTQVEEL KILIRMFPIWATGIVFSAVYAQMSTMF；motifs-8，IPPASLSTFDVISVIIWVPVYDRVLVPIARKF TGKERGFSELQRMGIGLF。

图7 同源进化关系分析

2.3 NRT1/PTR FAMILY 8.3基因在不同组织及胁迫中的表达分析

为了解草地早熟禾NRT1/PTRFAMILY8.3在不同组织的表达模式，采用实时荧光定量PCR相对定量方式进行了组织特异性表达分析，qPCR结果显示：草地早熟禾NRT1/PTRFAMILY8.3基因在不同组织部位中表达差异显著(图8-A)，相对表达量的高低依次为：根部>叶部>茎部，但根部和叶部的表达量差异不显著。

图8 草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3基因在不同组织及氮素、干旱处理中的表达分析

3 讨论

4 结论

本研究成功克隆获得草地早熟禾NRT1/PTRFAMILY8.3基因，该基因序列大小为2 274 bp，编码了419个氨基酸，含有MFS结构域，属于MFS超级家族，与二穗短柄草NRT1/PTR FAMILY8.3同源性最高。草地早熟禾NRT1/PTRFAMILY8.3基因在根部和叶部中表达量较高。无氮和高氮环境利于草地早熟禾NRT1/PTRFAMILY8.3基因表达，干旱促进NRT1/PTRFAMILY8.3基因表达；水氮互作时，低氮且干旱促进其表达，高氮且干旱抑制其表达。对草地早熟禾NRT1/PTRFAMILY8.3克隆与表达分析有利于进一步研究该基因功能。