海洋环境中抗生素抗性基因的水平传播研究*

苏 洁 付韵涵，2 明红霞 关道明 樊景凤#

(1.国家海洋环境监测中心，辽宁 大连 116023；2.大连海事大学环境科学与工程学院，辽宁 大连 116023)

近年来，由于抗生素的广泛使用加速了抗生素抗性基因(ARGs)在水生环境中的传播扩散，这些ARGs可能会通过直接或间接接触进入人体，从而给公共健康带来巨大威胁。世界卫生组织的报告显示，抗生素抗性已成为威胁人类健康的全球重大公共卫生安全问题之一。据报道，全球每年因耐药细菌感染而导致的死亡人数超过70万人，估计到2050年，耐药细菌感染将累计导致全球1 000万人死亡[1]。

海洋环境逐步成为ARGs传播扩散的重要媒介之一[2]，[3]7593。海洋环境中存在着3个层次的抗生素抗性污染源和传播载体：耐药细菌库、抗性质粒库和ARGs库。自然海水的流动特性加速了ARGs在海洋环境中的传播扩散，每一污染源和传播载体都呈指数形式扩散[4]。然而，目前关于海洋环境中ARGs的传播分布或基因类型的研究较少。因此，本研究结合国内外最新研究进展，综述ARGs水平传播的分子元件、海洋环境中水平基因转移(HGT)的分子机制和海洋环境中ARGs的种类、传播分布，以期为海洋环境中ARGs的传播扩散研究及污染防治提供理论依据。

1 ARGs水平传播的分子元件

环境细菌的抗生素抗性可以是固有的，也可通过自发突变或HGT获得。基因组中可移动遗传元件(MGEs)主要包括质粒、插入序列(IS)、转座子、基因组岛(GI)、整合子和噬菌体等，其可通过接合、转化、转导等方式进行基因水平传播。MGEs能介导环境中的ARGs形成基因簇并在不同宿主中扩散和传播。原核生物中发现的MGEs见表1。质粒是独立于染色体DNA复制的环状双链DNA分子，可编码多种遗传决定因子。赵莎[12]研究表明，娱乐海水环境分离的大肠杆菌菌株携带的耐药性基因可通过质粒接合在同种属菌株中进行传递。IS是最小且最简单的自主MGEs，其具有一个或两个开放阅读框，并编码被接头区域包围的转座酶。转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。转座子可携带ARGs在同种属及不同种属菌株间进行传递。整合子位于质粒和染色体上，具有用于捕获基因的位点特异性重组系统，移动基因盒中包含ARGs。GI是一类重要的MGEs，除携带有转座子、IS等分子元件外，也包含毒力因子、ARGs、代谢调控相关等功能基因。ICEs是与细胞染色体一起整合并与之复制的自交联MGEs。

表1 原核生物中发现的MGEsTable 1 MGEs found in prokaryotes

噬菌体是感染细菌以利用宿主细胞的代谢和复制机制组装自身的病毒。一些噬菌体可通过转导发挥HGT的作用，从而将DNA在细菌细胞间进行转移。当细菌DNA的片段随机包装在噬菌体颗粒中或特定的细菌DNA的某些区域与病毒基因组一起携带时，转导就成为一种较普遍的转移方式。噬菌体是目前已知的地球上数量最多的生物体，并且可通过基因转移改变细菌群落的结构和功能。PARSLEY等[13]发现，污水处理厂的噬菌体DNA和排污河流的水样中都存在β-内酰胺类和甲氧西林类ARGs，多家医院和污水处理厂排水中噬菌体DNA携带β-内酰胺类和喹诺酮类ARGs。由此可见，噬菌体在ARGs的水平传播中发挥着重要的作用。

2 海洋环境中HGT的分子机制

一直以来，主要有3种机制假说被认为可导致ARGs在海洋环境中的传播扩散：(1)通过陆地来源的耐药性细菌的沿海径流。然而，一些ARGs在海洋微生物类群中被检测到，因此从陆地来源导致的ARGs传播扩散不能完全解释这一现象。(2)海洋水产养殖相关活动产生的抗生素的入海径流，使天然细菌变得具有抗性。如智利海洋鲑鱼养殖场仅在2016年就使用了363.4 t抗生素，这种巨大的抗生素选择压力诱导了海洋环境中抗生素抗性的产生[14]。对波罗的海养殖场鱼肠样品进行宏基因组研究发现，鱼肠中的ARGs与养殖场沉积物中的ARGs相同，这表明鱼粪可能导致ARGs在养殖场沉积物中的富集。在进入海水养殖场前的幼鱼孵化和饲养期间使用抗生素可能是导致鱼肠中存在ARGs的原因。但也有人提出水环境中ARGs转移到鱼肠的可能性[15]。由于呋喃妥因和磺胺二甲氧嘧啶是人工合成抗生素，微生物相互作用中不会产生此类化合物，因此呋喃妥因和磺胺二甲氧嘧啶ARGs的产生可能是抗生素压力选择的结果。从人工海水养殖区附近海域中也分离到多种耐药细菌[16-19]。此外，PORT等[20]研究表明：近岸海域ARGs的检出率较高，推断人为输入可能影响ARGs的迁移模式；开放海洋样本中ARGs的检出率低于靠近岸边样本，而ARGs在近海(如夏威夷海)和近岸(如洛杉矶港)环境中检出率是相似的。(3)对海洋环境中抗性活性物质的自然选择。微生物间的拮抗作用可能发生在海雪或海水中的小颗粒上[21]。这些相互作用可能导致海洋中抗性活性物质的产生及其抗性的选择。如通过预过滤去除颗粒，颗粒相关的微生物相互作用可能就不会对抗性选择产生明显影响。然而，使用具有扩散性能的化合物时，微生物间相互作用也会发生在水体中[22]。如果这种相互作用是常见的，这可能导致海洋环境中ARGs的广泛存在。

2015年，HATOSY等[3]7598基于宏基因组学研究结果提出了第4种可能机制：某些蛋白质会通过调节微生物自身细胞代谢过程对抗生素产生抗性。他们的数据支持了这一假设，因为有些ARGs同时也在细胞代谢过程中发挥主要功能(如转运蛋白、氧化还原酶和水解酶)。来自两种抗生素敏感菌株的基因转化到宿主细胞时也会产生抗性，这一选择机制可以解释对人工合成抗生素(如磺胺二甲氧嘧啶和呋喃妥因)的耐药性，也能部分解释ARGs在水生环境中的高检出率和高多样性。增加的基因表达或蛋白质相互作用，可能会产生新的基因组并诱导抗性。因此，海洋环境中的生物体可能是大量潜在ARGs的储存库，这些基因可在某些环境条件刺激(如存在合适的启动子)下产生抗性。

3 海洋环境中ARGs的种类及传播分布

海洋环境中的ARGs主要源于污水处理厂、抗生素生产厂、养殖场。然而，每一排放源对于海洋环境中ARGs的输入类型、影响程度及总量占比目前尚不清楚[23]。ARGs已在近岸海域、深海、极地等不同海洋环境中被检出。通过培养实验和定性聚合酶链式反应(PCR)方法相结合，目前已在海洋环境中检测到四环素、磺胺、氟喹诺酮、第3代头孢、广谱β-内酰胺酶产生菌、氯霉素耐药菌及相关ARGs。渤海、黄海和东海沉积物中均检测到较高丰度的磺胺类ARGs——sul1和sul2(见表2)，而南海深海沉积物中大环内酯类及多肽类ARGs丰度较高。宏基因组数据显示，受人类活动影响较频繁的珠江河口的沉积物中ARGs比南海深海更加多样化，同时珠江口沉积物中丰度最高的3种ARGs与磺胺类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类抗生素浓度呈显著相关，说明该地区ARGs的传播可能主要受人类活动影响[28]。SUZUKI等[30]对马尼拉海湾海水中ARGs研究发现，sul1和sul2是可培养细菌中的主要磺胺类ARGs，而sul3是由海水中不可培养细菌传播的。ZHAO等[31]调查了海河河口沉积物中ARGs胞外和胞内DNA的分布，结果表明，沿海地区样本中多重耐药基因高度多样化且丰富。ZHU等[32]采用高通量定量方法在中国沿海18个河口沉积物中均检测到ARGs。

表2 海洋环境中ARGs和MGEs的种类和分布Table 2 Types and distribution of ARGs and MGEs in marine environment

海水养殖环境中已发现磺胺类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类和喹诺酮类等ARGs，并普遍存在于养殖海水、沉积物和海产品体内。养殖海水中磺胺类(sul1和sul2)和四环素类(tetA和tetB)ARGs的检出丰度较高，但不同采样点差异较大。CHEN等[37]对中国13个主要海水养殖场中ARGs的调查发现，养殖海水和沉积物中磺酰胺类ARGs的绝对拷贝数和相对丰度分别比四环素类ARGs高4.3、2.3倍，其中主要的ARGs为sul2。为克服现有ARGs引物的局限性，GAO等[38]采用Illumina高通量测序来分析中国沿海10个养殖场沉积物中ARGs，结果表明，所有沉积物样品中bacA的丰度最高，其次是mexF和mexB。近年来，国内外学者对海水养殖环境中ARGs的调查发现，水产养殖不仅会增加附近海域的ARGs丰度，还会增加远离水产养殖区域的环境中多重耐药性细菌的检出率[48-49]。

娱乐海洋环境传播的微生物疾病已逐步成为公众关注的首要问题之一，目前国内外学者也对海水浴场中ARGs进行了大量研究。研究表明，英国近岸海水浴场中冲浪者肠道内含有耐药性大肠杆菌的检出率是普通人的3倍[39]。TURGEON等[40]检测发现，2005年在魁北克南部近200个海水浴场中采集的海水样品中耐药性大肠杆菌的检出率比2004高10%。KOTLARSKA等[41]调查表明，葡萄牙Berlenga浴场海水中大肠杆菌多重耐药率高达39%，并检测到质粒介导的超广谱β-内酰胺酶基因(blaTEM)及喹诺酮类ARGs(qnrS1)。ANDRADE等[42]发现，耐药性大肠杆菌在浴场湿砂、干砂中的检出率(53.7%、53.8%)比浴场海水中(50%)高。研究发现，大连星海浴场海水中大肠杆菌多重耐药状况严重，耐药菌株中四环素类ARGs的阳性检出率最高[43-44]。相较远海而言，近岸海域中多种ARGs和MGEs的高度富集进一步证明了人类活动对ARGs产生和传播的重要影响[45]。

原始的极地海洋环境也发现了ARGs。北极海洋沉积物中检测到26种ARGs，定量PCR检测结果表明，磺胺类ARGs(sul1、sul2和sul3)丰度最高，β-内酰胺类ARGs(blaSHV-1、blaGES-1、blaNDM-1和blaKPC)未检出[46]。南极海水样品中分离到携带广谱β-内酰胺酶型CTX-M基因的细菌，多位点序列分型技术结果表明，此细菌已在人体中被分离出，这说明与人类相关的ARGs已传播扩散到全球[47]。北极新奥尔松地区鹿粪及鸟粪粪土中分离到的85株大肠杆菌对利福平全部耐药，南极企鹅粪便中也分离到耐药性大肠杆菌，这说明抗生素抗性已出现于极地野生动物肠道菌群中[50]。

4 结 语

ARGs不再仅仅是一个临床问题，大量天然ARGs库的发现更凸显了自然环境在ARGs传播中的作用。海洋覆盖地球表面积的70%，包含1029数量级的细菌细胞，也是一个具有多层次耦合的自然系统。鉴于海洋容易快速输送水团，并且是海洋经济生物的重要栖息地，海洋环境可能是ARGs的重要全球储存库。海洋中水、汽、冰三态转化的复杂性及海水在包括波浪、潮汐、海流等水文动力下的不停运动，都会直接或间接影响海洋环境中的微生物生境，进而影响细菌耐药性的传播扩散。虽然ARGs在海洋环境耐药性传播中的重要性已被认识到，但目前国内外研究仅局限于海洋生物体或微生物耐药性及其ARGs检测层面，ARGs在海洋环境及海洋细菌间的传播扩散机制和在海洋生态系统食物链中的传递机制等问题还有待后期深入研究。

大量研究表明，海水养殖环境中抗生素与其相关ARGs之间存在显著相关性，因此通过海水循环、沉积物悬浮和生物体迁移，大量的抗生素残留物和ARGs可能最终被传播到海洋环境中。未来的研究应集中在减少海水养殖中使用抗生素和控制ARGs的传播扩散方面。政府应制定更严格的标准来规范抗生素的使用和监测，建议考虑将养殖废水和污泥中的ARGs作为监测指标，以便有效控制抗生素污染。

近年来，随着宏基因组测序技术的发展，一些非培养的技术手段在微生物研究中发挥着日益重要的作用。宏基因组测序技术能快速高效地获取整个微生物群落的基因组信息，对ARGs的探索也能扩展到更广泛的生物体，包括不可培养的物种。这些进步将增加微生物群落间ARGs水平传播途径的认识。考虑到ARGs是“容易获得，难以丢失”的污染物，并且可能在无抗生素压力环境中检测到，因此科学界和政府也应该共同合作，制定相关政策和研究计划减少抗生素的使用，从而减少ARGs在临床和环境中的传播和扩散。