耐高温油脂降解菌株的筛选、鉴定及其在好氧堆肥中的应用*

詹亚斌 魏雨泉 陶兴玲 张阿克 林永锋 丁晓艳 范鑫祺 李 季#

(1.中国农业大学资源与环境学院，北京 100193；2.中国农业大学有机循环研究院(苏州)，江苏 苏州 215100)

餐厨垃圾是我国主要的城市有机废弃物之一，每年产生量约为9 000万t[1]。随着北京、上海、苏州等地餐厨垃圾分类工作推进，餐厨垃圾收集量将持续增长，大量的餐厨垃圾如不及时处理，将会给居民的生产、生活带来不利影响。分类后的餐厨垃圾含水率极高(通常在90%以上)，热值极低[2]，增加了填埋、焚烧的处理难度和成本；填埋会污染地下水，占用土地，焚烧会污染大气。好氧堆肥技术因其成本低、无害化程度高、处理能力大、处理后的产品可以直接施用于土壤，已经成为处理餐厨垃圾的一个重要手段[3]。

与畜禽粪便、园林垃圾、农业秸秆等废弃物相比，餐厨垃圾具有独特的性质，例如含油量高(1%(质量分数，下同)～5%，湿基)，这对餐厨垃圾好氧堆肥带来了新的挑战[4]。油脂会包裹在物料表面，阻碍微生物对物料碳水化合物、蛋白质等的降解，抑制餐厨垃圾好氧堆肥的启动[5]。大量研究者尝试将餐厨垃圾在前端去除油脂后进行堆肥，虽然效果尚可，但是费时费力，导致最终处理成本增大[6]。关于油脂降解菌的筛选报道很多，罗跃中等[7]筛选获得一株菌，最适生长温度为32 ℃，在液体培养基中培养3 d的油脂降解率为81.6%；康燕莉等[8]筛选获得一株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，最适生长温度为35 ℃，在液体培养基中培养2 d的油脂降解率为87.4%；这些微生物可以用来降解污水中的油脂；但是，可能无法应用于堆肥环境。餐厨垃圾好氧堆肥会经历一个高温过程，为了杀灭堆体中的病原菌，通常要求堆体维持高温(>50 ℃)5 d以上。因此，要求接种的微生物对温度有很好的耐受性。同时为了达到良好的油脂降解效果，一般要求接种的微生物从该种物料中筛选获得，这样有利于微生物的快速繁殖，从而达到快速降解油脂的目的。

本研究从餐厨垃圾好氧堆肥高温期样品中富集驯化、筛选获得耐高温油脂降解菌株，将其复配接种到餐厨垃圾堆肥中，期望降解餐厨垃圾中的油脂，加快餐厨垃圾好氧堆肥腐熟进程。本研究可为基于生物强化技术的餐厨垃圾资源化处理工艺奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株筛选样品

菌株筛选样品采集自中国农业大学有机循环研究院(苏州)，取某次餐厨垃圾好氧堆肥高温期样品500 g，用于筛选耐高温油脂降解菌株[9]。

1.2 培养基

富集培养基：大豆油(大豆油作为唯一碳源，质量浓度随初筛中的周期逐次递增，分别为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 g/L)，MgSO4·7H2O 0.1 g，(NH4)2SO41.0 g，KH2PO40.3 g，K2HPO41.5 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏蛋白胨培养基中添加20 g琼脂粉。包括平板、斜面两种类型。

中性红培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基中添加1.6%(质量分数)中性红水溶液1 mL、大豆油5.0 g。

油脂降解能力测定培养基：大豆油质量浓度为5.0 g/L，其他与富集培养基配方一致。

1.3 耐高温油脂降解菌株的筛选及其油脂降解能力

(1) 油脂降解菌的初筛：称量堆肥样品5 g于45 mL富集培养基中，30 ℃、180 r/min培养6 d，然后吸取5 mL菌液于45 mL新的富集培养基中，相同条件下培养6 d，如此驯化5个周期。将第5个周期的菌液，稀释涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板培养基上，挑选不同形态特征的菌落进行划线分离，纯化后的菌株保存于牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基中备用[10],[11]61。

(2) 油脂降解菌的复筛：将菌株接种于中性红培养基上，30 ℃培养48 h，观察菌落是否变红，变红则表示菌株能够降解油脂并产生脂肪酸。

(3) 耐高温油脂降解菌的筛选：将分离纯化的菌株，接种于牛肉膏蛋白胨固体平板培养基中，分为3组，分别置于50、60、70 ℃培养箱中，48 h后观察菌株的生长情况。将筛选出的菌株保存于牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基中。

(4) 耐高温油脂降解菌的油脂降解能力测定：将筛选出的菌株接种于牛肉膏蛋白胨固体平板培养基中，30 ℃、180 r/min培养24 h，调节菌液使其在600 nm波长处的吸光值(OD600)为1.0，按照5%(体积分数，下同)接种量接种至油脂降解能力测定培养基中，30 ℃、180 r/min培养8 d，采用重量法测定大豆油的含量，计算油脂降解率[12]。

1.4 菌株的鉴定

采用煮沸法获得DNA模板，送至上海某生物科技公司测序(16S rDNA)，引物分别为27F和1492R，将基因测序结果在GenBank中BLAST比对，采用MEGA 6.0对16S rDNA结果进行比对分析，并画系统发育树[11]63。

1.5 菌株拮抗实验

采用牛津杯法对菌株(筛选得到的2株耐高温油脂降解菌分别记为HBT-2和HBT-12)进行拮抗实验。采用预加菌液倾注平板法，往已冷却50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨固体平板培养基中接种20%的种子液(油脂降解菌在牛肉膏蛋白胨培养基中30 ℃、180 r/min培养2 d)，混合均匀，倾注凝固后备用。将已经灭菌的牛津杯置于实验平板中，往牛津杯中加入10 μL种子液，30 ℃培养48 h，观察菌株之间是否产生拮抗作用[13]。

1.6 堆肥材料

餐厨垃圾取自苏州市某中学食堂，锯末购买自苏州市某木材厂，堆肥材料基本性质见表1。

表1 堆肥材料基本性质Table 1 Basic properties of composting materials

1.7 好氧堆肥

1.7.1 实验设计

将餐厨垃圾与锯末按照4∶1(湿基质量比)混合均匀，在长、宽、高、壁厚分别为67.5、48.0、41.0、3.5 cm的反应器中装入60 kg堆肥材料，进行21 d的好氧堆肥。实验一共设计2个处理，对照组(CK)不接菌，接种组接种1%菌液(2株菌体积比1∶1；菌株>108cfu/mL)；用接种环挑选一环微生物于100 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，30 ℃、150 r/min培养24 h；将培养24 h的菌液作为种子液，接种于5 L牛肉膏蛋白胨培养基中，逐步扩大培养(按照2%的接种量对微生物扩大培养)；每个处理设置3个重复。分别于0、3、6、9、12、15、18、21 d在每个反应器中进行多点取样，混合成一个样后采用四分法收集样品500 g,250 g保存于4 ℃备用，250 g风干、磨碎、过筛备用。每次取样后进行人工翻堆。

1.7.2 测定方法

采用便携式电子温度计于每天9:00和15:00多点测定堆体温度。含水率、pH和EC的测定参考《有机肥料》(NY 525—2012)进行。总有机碳(TOC，质量分数)和总氮(TN，质量分数)采用元素分析仪(Vario EL)测定，C/N通过TOC和TN计算，C/N = TOC/TN[14]。发芽指数(GI)测定采用黄瓜种子发芽情况计算得出[15]。油脂采用重量法测定，具体参考文献[11]。

2 结果与分析

2.1 耐高温油脂降解菌株的筛选

筛选获得的2株耐高温油脂降解菌HBT-2、HBT-12最高耐受温度分别为50、60 ℃，在油脂降解能力测定培养基上的油脂降解率分别为30.40%、27.45%。

2.2 油脂降解菌株的分子生物学鉴定

将菌株HBT-2和HBT-12的16S rDNA基因序列提交GenBank数据库，获取序列登录号分别为MN443606和MN443611。菌株系统发育树见图1，菌株HBT-2和泛酸枝芽孢杆菌(Virgibacilluspantothenticus)PBBS3在同一分支上；菌株HBT-12和地衣芽孢杆菌DSM 13在同一分支上。因此，经初步鉴定，菌株HBT-2归属于枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)，HBT-12归属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

图1 菌株HBT-2和HBT-12的系统发育树Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of HBT-2 and HBT-12

2.3 菌株拮抗实验结果

2株菌之间没有出现抑菌圈，说明2株菌之间没有拮抗作用，因此可以将2株菌复配接入堆肥中。

2.4 堆肥理化指标

2.4.1 温 度

温度是堆肥过程的一个关键指标，通常通过温度上升与否判别堆肥是否正常启动，堆肥一般包含3个温度变化阶段：升温期、高温期、降温期[16]。2个处理的温度呈现先上升后下降的趋势(见图2)。1～3 d，2个处理的温度较为平稳，可能是餐厨垃圾中油脂抑制了微生物的生长，导致温度无法继续上升。4～12 d，接种组和CK的温度分别由46.7、45.4 ℃上升至最高温度63.2、58.3 ℃，且接种组比CK的温度高，两者具有显著性差异(p<0.05)；说明接种耐高温油脂降解菌可以促进堆体升温。13～21 d，2个处理的温度呈现总体下降趋势；14 d以后，接种组温度比CK低。在整个堆肥过程中，CK的高温持续时间为9 d(堆肥第8～16天)；接种组的高温持续时间为10 d(堆肥第6～15天)，且其中有3 d的温度>60 ℃，两者均达到堆肥腐熟标准(参考NY 525—2012，下同)中对温度的要求(>50 ℃，持续5 d以上)；说明接种耐高温油脂降解菌可以使堆体提前2 d进入高温期，提前1 d进入降温期，且高温持续时间更长，更有利于杀灭病原菌。当堆体温度>60 ℃，接种的2株芽孢杆菌可能会休眠或者死亡；一旦温度适宜，芽孢杆菌产生的孢子会立即复苏，依然能降解堆肥中的油脂。因此，将芽孢杆菌接种于堆体是十分适宜的。堆肥过程中，也可以通过翻堆、补水等方式给堆体降温，避免过高的温度造成有益微生物的死亡，对好氧发酵产生不利影响。化党领等[17]在猪粪堆肥研究中发现，翻堆可以促进堆体降温，同时可以给堆体带来大量氧气，有利于微生物生长，可以促进堆肥腐熟进程。

图2 堆肥中温度随时间的变化Fig.2 Change of temperature in composting with time

2.4.2 含水率

水分可以反映微生物的活跃程度，微生物生长、繁殖需要消耗大量水；同时，堆体在升温过程中，会加快水分蒸发，从而使水分急剧减少。2个处理的含水率呈现下降趋势，CK、接种组的含水率分别由0 d的69.36%、69.49%下降至21 d的53.55%、49.20%(见图3)；在整个堆肥过程中，接种组的含水率均低于CK，说明接种耐高温油脂降解菌可以促进含水率的下降。堆肥结束，2个处理的含水率均在45%以上，未达到腐熟标准(堆肥成品要求含水率<45%)，可能是堆体初始含水率过高(接近70%)导致的。王晓君等[18]3217在餐厨垃圾好氧堆肥研究中发现，添加不同比例辅料的3个处理的堆体初始含水率为60%～65%，经过14 d，含水率均下降至45%以下，达到堆肥腐熟对含水率的要求。因此，在堆肥初期可以加大辅料添加量，调整堆体初始含水率至65%以下，便于堆肥快速腐熟。

图3 堆肥中含水率随时间的变化Fig.3 Change of moisture content in composting with time

2.4.3 pH

堆肥材料的初始pH较低，在3.5以下；可能是餐厨垃圾在收集、储存、运输过程中经历了厌氧发酵导致的[18]3216。一般情况下，随着堆肥的进行，微生物开始分解蛋白质生成氨基酸，会导致pH略微下降；当氨基酸进一步脱氨基生成氨氮等碱性物质，会导致堆肥pH开始上升[19]。2个处理的pH呈上升趋势(见图4)，接种组和CK的pH分别由0 d的3.39、3.36上升至21 d的8.22、7.48；接种组的pH在12 d达到7.47，CK的pH在18 d达到7.11，接种组比CK提前6 d达到>7，说明接种耐高温油脂降解菌可以促进堆肥pH的上升。

图4 堆肥中pH随时间的变化Fig.4 Change of pH in composting with time

2.4.4 EC

EC反映了堆肥浸提液中的离子浓度，腐熟标准中要求EC<4 mS/cm[20]。接种组的EC呈现先上升、后下降的趋势，CK的EC呈现先上升、后保持平稳的趋势(见图5)。0～12 d，接种组和CK的EC呈上升趋势，分别由2.70、2.69 mS/cm上升至4.62、4.42 mS/cm，可能是堆肥材料在降解过程中释放矿物盐分和铵根离子，导致EC上升；接种组的EC显著大于CK(p<0.05)，说明接种促进了堆肥中有机大分子的分解。堆肥结束，接种组的EC下降至3.77 mS/cm，达到腐熟标准；CK的EC为4.32 mS/cm，未达到腐熟标准。可能是接种促进堆体CO2、NH3的挥发，胡敏酸物质和阳离子交换量的升高，导致EC下降[21]。

图5 堆肥中EC随时间的变化Fig.5 Change of EC in composting with time

2.4.5 TOC、TN、C/N

由图6(a)可知，2个处理的TOC呈下降趋势。在整个堆肥过程中，接种组的TOC显著低于CK(p<0.05)；堆肥结束，接种组和CK的TOC分别降低了6.59百分点、3.01百分点；说明接种有利于TOC的降解，这与杜龙龙等[22]的研究结果相一致。

图6 堆肥中TOC、TN、C/N随时间的变化Fig.6 Changes of TOC，TN，C/N in composting with time

2个处理的TN呈现先下降、后上升的趋势(见图6(b))。0～6 d，2个处理的TN呈下降趋势，接种组和CK的TN均由0 d的1.71%分别下降至6 d的1.51%、1.54%，分别下降了0.20百分点、0.17百分点；可能是接种促进了堆体的升温、pH上升，导致氮以NH3的形式损失了。9～21 d，2个处理的TN呈上升趋势，接种组和CK的TN分别由9 d的1.62%、1.46%上升至21 d的1.87%、1.78%，分别上升了0.25百分点和0.32百分点。

接种组的C/N呈现先平稳、后下降的趋势，CK的C/N呈先上升、后下降的趋势(见图6(c))。0～6 d，接种组的C/N较为平稳，保持在28.07～28.29，可能是TOC降解速率与TN损失速率持平，导致C/N无较大变化；CK的C/N呈上升趋势，由28.47上升至30.77，可能是TOC降解速率低于TN损失速率导致的。9～21 d，2个处理的C/N均呈下降趋势，这可能是TOC的降解速率较大导致的；接种组的C/N比CK低，说明接种可以促进C/N的下降，有利于堆肥的腐熟。

2.4.6 GI

GI是重要的腐熟度评价指标之一。当GI>50%时可以认为堆肥对植物基本没有毒害，当GI>80%时，可认为达到腐熟标准[23]。2个处理的GI均呈现先下降、后上升的趋势(见图7)。0～3 d，2个处理的GI呈下降趋势，接种组和CK的GI分别由45.45%、45.61%下降至39.64%、41.04%，可能是因为在堆肥前期，微生物分解油脂，产生有机酸，抑制了GI的上升。6～21 d，2个处理的GI呈上升趋势，且接种组始终显著大于CK(p<0.05)；堆肥结束，接种组的GI上升到85.90%，达到腐熟标准；CK的GI为76.68%，未达到腐熟标准，说明接种可以促进堆肥的腐熟。

图7 堆肥中GI随时间的变化Fig.7 Change of GI in composting with time

2.5 油脂降解率

2个处理的油脂降解率呈上升趋势(见图8)。整个堆肥周期，接种组的油脂降解率显著大于CK(p<0.05)。0～6 d，接种组和CK的油脂降解率分别上升至3.55%、5.67%，上升速率较慢，可能是堆肥前期微生物生长较慢，且微生物分解油脂产生脂肪酸等不利于微生物生长，导致油脂降解率较低。9～21 d，接种组和CK的油脂降解率迅速上升，分别由18.56%、5.75%上升至38.62%和26.51%，接种组比CK高12.11百分点，说明接种耐高温油脂降解菌可以显著促进堆肥油脂的降解(p<0.05)。接种组堆肥高温期(第6～15天)油脂降解率占到整个降解率的73.78%，说明油脂降解主要发生在堆肥高温期。可能是高温可以使餐厨垃圾的固态动物油脂变成液态，加大微生物与油脂的接触比表面积，从而提高油脂的降解效率[24]。

图8 堆肥中油脂降解率随时间的变化Fig.8 Change of oil degradation rate in composting with time

3 结 论

(1) 从餐厨垃圾堆肥中筛选获得2株菌，分别记为HBT-2、HBT-12，其最高耐受温度分别为50、60 ℃，在油脂降解能力测定培养基上的油脂降解率分别为30.40%、27.45%；经16S rDNA初步鉴定为枝芽孢杆菌属和芽孢杆菌属。

(2) 堆肥结束，接种组的EC为3.77 mS/cm，GI为85.90%，达到腐熟标准；CK的EC为4.32 mS/cm，GI为76.68%，未达到腐熟标准。

(3) 在堆肥结束，接种组的油脂降解率为38.62%，比CK的26.51%高12.11百分点，差异显著(p<0.05)。接种组在高温期(第6～15天)的油脂降解率占到整个堆肥周期的73.78%，说明油脂降解主要发生在堆肥高温期。