湖北省茶叶中吡咯里西啶生物碱污染概况及健康风险评估

夏珍珍 彭茂民 郑 丹 夏 虹 周有祥 彭立军 王 清

（1.湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（武汉），湖北省农产品营养品质与安全重点实验室，武汉 430064；2.丹江口市农业环境保护站，湖北丹江口 442700）

茶叶是在全球范围内广泛饮用的饮品之一，茶叶及其饮用方式带来的养生价值受到人们普遍关注。湖北是“茶祖”神农、“茶圣”陆羽的故乡，产茶历史悠久，且拥有良好的气候资源优势，属于中国茶叶四大产区之一的江南产区[1～2]。目前，在湖北省内形成了4个优势产区，即鄂东北大别山产区、鄂西南武陵山产区、鄂西北秦巴山产区和鄂南幕阜山边销茶产区，且逐渐形成了涵盖绿茶、红茶、砖茶等的名优茶品[3～4]。湖北的茶叶产区主要分布在山区，是湖北山区县级发展的支柱产业，也是山区解决劳动力和乡村振兴的重要产业方向。茶叶是多年生木本植物，田间生长周期长，在种植阶段容易受到产地环境污染的影响，如环境水、土壤、空气中的重金属、有机污染物、毒素等有害物质会通过叶片和根系的作用吸收进入茶叶叶片，从而对最终的茶叶产品造成污染[5]。

吡咯里西啶生物碱（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是一类由紫草科、菊科、豆科等植物产生的天然毒素，用于防御和抵抗昆虫和食草动物对其的侵害[6]。PAs具有的特殊结构对动物和人类有一定的毒性，侵害的毒性主要通过摄入含有PAs毒性的中草药和受PAs污染的食物，包括蜂蜜、肉类、谷物、茶叶等[7～8]。摄入人体内的PAs大部分通过肾脏和尿道排除，但是仍然有部分PAs会通过肝脏转化从而跟体内的DNA和蛋白质结合导致肝毒性和遗传毒性[9～10]。因此，关注暴露和不知情摄入PAs的情况具有重要的意义。

有研究表明，虽然茶叶本身并不属于产生PAs的植物，但是茶园中的杂草中往往含有PAs，且会通过根系的作用从而污染茶叶叶片[11]。近年来，德国联邦风险评估研究所发现德国市场上的部分茶叶中检出PAs类生物碱，且部分样品中含量高，虽然短期饮用不会造成急性健康风险，但是长期的暴露则会存在健康风险[12]。目前，对于我国茶叶中PAs的暴露水平及其健康风险方向的研究较少，因而需要对我国茶叶中PAs的污染水平进行调研分析。基于此，选取湖北省主要的茶叶主产区，采集不同季节和不同种类的干制茶样品，采用超高效液相色谱串联质谱法（UPLC－MS/MS）分析干制茶样品中PAs含量水平，比较不同产地、不同茶叶种类、不同季节的茶叶中PAs含量间的差异变化，描绘湖北省茶叶中PAs的污染特征。另外，结合主产茶区茶园杂草的调研取样分析，确定茶叶中PAs的可能污染来源和主要单一种类。最后，通过专门的健康风险评估模型对其健康风险进行评估，为湖北省茶叶的PAs风险监测提供支撑数据，为未来制定相应的管控措施提供理论参考。

一、样品采集及制备

（一）茶叶样品的采集及制备选取湖北省5个茶叶产区开展茶叶（红茶、绿茶和砖茶）中PAs的排查，共采集茶叶样品89份，其中宜昌地区茶叶样品49份（红茶样品41份、绿茶样品8份）；恩施地区茶叶样品10份（绿茶样品5份、红茶样品5份）；咸宁砖茶样品10份；英山绿茶样品10份；大悟绿茶样品10份。这批茶叶样品又可依据采摘的季节不同将其细分为春、夏、秋茶3类。采集的干制茶通过高速中药磨粉机进行粉碎，过100目筛，后装入自封袋4℃避光保存，以待检测。

（二）杂草样品的采集及制备选取茶园3处，采集茶园中主要杂草样品，去除杂草根部和黄叶子，保留其他部分，切碎后用打碎机打成杂草浆，－18℃冷冻保存。

二、分析方法

（一）试剂与仪器共选择了15种PAs，包括天芥菜碱（heliotrine，He）、天芥菜碱－N－氧化物（heliotrine－N－oxide，HeNO）、促黑激素（intermedine，Im）、促黑激素－N－氧化物（intermedine－N－oxide，ImNO）、千里光碱（jacobine，Jb）、千里光碱－N－氧化物（jacobine－N－oxide，JbNO）、倒千里光碱（retrorsine，Re）、倒千里光碱－N－氧化物（retrorsine－N－oxide，ReNO）、千里光宁碱（senecionine，Sc）、千里光宁碱－N－氧化物（senecionine－N－oxide，ScNO）、千里光菲灵碱（seneciphylline，Sp）、千里光菲灵碱－N－氧化物（seneciphylline－N－oxide，SpNO）、克氏千里光碱（senkirkin，Sk）、欧天芥菜碱（europine，Eu）、欧天芥菜碱N－氧化物（europine N－oxide，EuNO）。标物由中国农业科学院茶叶研究所提供，用乙腈（色谱纯，国药集团）配置成10 mg/L的储备液，4℃避光保存。浓硫酸（分析纯，国药集团）、甲酸（色谱纯，国药集团）、氨水（色谱纯，国药集团）、甲酸铵（优级纯，阿拉丁试剂公司）、PCX固相萃取柱（200 mg/6 mL，美国安捷伦公司）、0.22μm水系针式过滤头（天津市津腾实验设备有限公司）。

UPLC－MS/MS，包括LC－30AD液相色谱仪（日本Shimadzu公司）和Qtrap 4500串联四极杆质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）。数据采集通过Analyst工作站，数据处理为MultiQuant分析软件。ME－2002E 102型电子天平（瑞士梅特勒－托利多仪器公司）、MS 3型涡旋仪（德国IKA公司）、TDL－5C台式大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）、Milli－Q超纯水处理仪（美国Millipore公司）、高速中药磨粉机（济南达微机械有限公司）。

（二）前处理方法PAs的分析方法参考文献[13～14]，取1.00 g茶叶粉末或杂草浆于50 mL离心管中，加入10 mL 0.1 mol/L硫酸，涡旋2 min，静置过夜（或超声15 min）提取，经10 000 r/min离心10 min，上清液转移到50 mL离心管中；残渣再加入10 mL 0.1 mol/L硫酸，超声15 min，经10 000 r/min离心10 min；将上述2次制备的上清液合并，取10 mL，待固相萃 取（solid phase extraction，SPE）净化。分别采用5 mL甲醇与5 mL去离子水活化PCX SPE柱，再将上述待净化的10 mL上清液分2次加入PCX SPE柱；待上清液的液面与SPE上层齐平时，分别采用5 mL去离子水（含1%甲酸）与5 mL甲醇进行淋洗，再采用5 mL甲醇（含0.5%氨水）洗脱；洗脱液经0.22μm滤膜于UPLC－MS/MS自动进样瓶，待UPLC－MS/MS分析。

（三）仪器方法色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8μm），流动相A为1 mmol/L甲酸铵甲醇溶液（含0.1%甲酸），流动相B为1 mmol/L甲酸铵水溶液（含0.1%甲酸），洗脱梯度见表1。流速为0.25 mL/min；柱温为40℃；进样量为2μL。正离子电喷雾电离（ESI+），多反应监测模式（MRM），MRM参数见表2。工作曲线的浓度范围为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L，外标法定量，采用同种类茶叶或同一科属杂草配制基质标准溶液进行定量。

（四）数据分析分析茶叶中PAs的总量水平（最高值、最低值、中值、平均值和95%分位值），确定总体污染状况，通过分析单一PAs检出率和含量水平，确定主要污染成分。按不同茶类、不同产地和不同季节分析PAs总量和单一种类PAs的污染差异，比较茶叶中PAs污染水平和茶园中杂草PAs种类和含量相关性，分析茶叶中PAs的可能的杂草来源。通过Excel 2010进行数据分析，Origin Pro 9.0绘制图表。

三、结果与分析

（一）茶叶中PAs检出基本情况

1.茶叶中PAs的检出率、检出种类和浓度分布范围。分析89份茶叶样品PAs的检出率和检出种类情况，发现89份茶叶样品中，18份茶叶样品中检出PAs，湖北省茶叶样品中PAs的整体检出率为20.2%。其中检出的浓度范围在1.15～34.45 μg/kg，中 位 值4.02μg/kg，平 均 值7.78μg/kg，95%分 位 值 为27.47μg/kg。KALTNER等[13]和SCHULZ等[15]分析了德国市售的品牌花草茶，发现茶叶 中 的PAs的 含 量 范 围 在0.3～253.4μg/kg。MATHON等[16]的研究表明瑞士品牌花草茶中PAs的含量在0.02～1.90μg/L。PICRON等[17]的研究表明比利时的茶叶中PAs含量范围在43～113μg/kg。茶叶中的PAs污染问题已经受到全球国家的关注，对比发现，湖北茶叶中PAs的含量分布整体较低，德国和比利时茶叶中PAs污染水平较高，这也可能是因为湖北的茶叶种类主要是红茶、绿茶和砖茶为主，德国和比利时的茶叶以花草茶为主。

分析单一PAs的检出情况可知，15种PAs中阳性检出的包括Jb、JbNO、EuNO、ReNO、Sp和Sk 6种，He、HeNO、Im、ImNO、Eu、Re、Sc、ScNO和SpNO共计9种未检出。单一PAs的含量水平（最高值、最低值、中值和95%分位值）等统 计 信 息 见 表3。其 中，Jb、JbNO、EuNO、ReNO、Sp和Sk单一PAs检出率分别为1.1%、6.7%、2.2%、5.6%、2.2%和2.2%。比较发现，JbNO的检出率最高，ReNO检出率次之，EuNO、Sp和Sk检出率相当，位列第三，Jb的检出率最低。6种单一PAs中，EuNO的平均含量最高，为16.53μg/kg。

表3 湖北茶叶中单一PAs统计情况

2.不同地区茶叶的检出情况。分析湖北省5个茶叶产区（宜昌、恩施、咸宁、英山、大悟）茶叶样品中PAs的检出率情况得出，5个产区中仅宜昌、咸宁、大悟3个产区有检出，检出率分别为30.6%、20.0%和10.0%，宜昌地区茶叶中PAs检出高出湖北省平均水平，恩施和英山的茶叶未检出PAs。检出产区的PAs分布情况见图1。其中，宜昌地区的茶叶检出PAs种类有7种，种类和频次分别为Jb检出2次、JbNO检出6次、EuNO检出1次、ReNO检出7次、ScNO检出6次、Sp检出2次、Sk检出7次。大悟地区的茶叶仅检出EuNO，检出1次。咸宁地区检出3种PAs，种类和频次分别为Sc检出1次、ScNO检出1次、Sk检出6次。

图1 不同产区茶叶中PAs分布情况

3.不同茶叶种类的检出情况。分析湖北省红茶、绿茶和砖茶3类茶叶中的PAs情况发现，红茶的检出率为28.3%；砖茶的检出率为20.0%；绿茶的检出率为9.1%。与全省茶叶的整体情况相比，红茶的PAs的检出率高于全省茶叶的平均水平；砖茶与全省PAs的检出水平相比，略低；绿茶的PAs检出率要远低于全省茶叶的PAs的检出率。不同种类茶叶PAs分布见图2。有研究表明，不同茶类的茶叶中[13]，博士茶中PAs污染最为严重，其次是花草茶和红茶，博士茶是一种草本茶类，易受茶园中杂草的污染。本文发现红茶中PAs的污染率较绿茶和砖茶高，也与文献中的发现较为一致。因而，按茶种类分，PAs的污染情况依次为博士茶>花草茶>红茶>绿茶>砖茶。

图2 不同产区茶叶中PAs分布情况

分析各类茶叶中PAs的检出种类和频次情况发现，红茶中检出Jb 1次、JbNO 5次、EuNO 1次、ReNO 5次、ScNO 6次、Sp 2次、Sk 7次，共计7种。绿茶中检出PAs共计4种，其中Jb、Jb-NO和EuNO检出频次各1次，ReNO检出2次。砖茶检出3种PAs，种类和频次分别为Sc 1次、ScNO 1次、Sk 6次。

4.不同季节茶叶的检出情况。从茶叶采摘的季节角度分析，发现春茶中PAs的检出率为16.7%；夏茶中PAs的检出率为30.4%；秋茶中PAs的检出率为12.5%。其中，夏茶的检出率水平要高于湖北省的平均水平，春茶和秋茶的检出率要远低于平均水平。按茶叶种类分，检出的PAs的含量分布情况见图3。

图3 不同季节茶叶中PAs分布情况

分析各季茶叶中PAs的检出种类和频次情况发现，春茶中检出JbNO 3次、EuNO 1次、ReNO 3次、ScNO 4次、Sp 1次、Sk 4次，共计6种。夏茶中检Jb 2次、JbNO 2次、ReNO 4次、ScNO 2次、Sp 1次、Sk 3次，共计6种。秋茶中检出JbNO和EuNO各1次。

（二）茶园杂草中PAs检出基本情况实地调查茶园中杂草情况，采集杂草样品24份，共涉及杂草种类18种。通过对茶园杂草的PAs分析，杂草中PAs的检出率为79.2%，平均值为3.871×103μg/kg，含量范围为1.86～2.67×104μg/kg。考察单一PAs的检出率，杂草中检出的PAs共有12种，分别的检出率分布见图4。位于前三位的为JbNO、ReNO和ImNO，检出率分别为58.3%、54.2%和25.0%，检出平均值分别为1.72×103、2.65×103、1.56×103μg/kg，其他PAs的含量分布见表4。

表4 湖北茶园杂草中PAs统计情况

图4 湖北茶园杂草中单一PAs检出率分布

通过分析杂草种类，野葵花、乌蔹莓、藿香蓟、野茼蒿、竹叶草、鹅肠草、狗尾草、牛膝菊、辣蓼、美洲商陆、牛筋草、马唐、鸭跖草、夏堇、鱼腥草、牛筋草这几种杂草中都不同程度地检出PAs。其中野茼蒿、乌蔹莓中的JbNO和ReNO二者含量较高；藿香蓟、鸭跖草、鹅肠草中的ImNO含量较高。对比分析茶叶中PAs含量和杂草中PAs含量平均值，茶叶中PAs含量约为杂草中PAs含量的1‰左右，杂草中检出率前两位的PAs为JbNO、ReNO，与茶叶中检出率前两位的PAs种类一致。因而，杂草可能是茶叶的PAs的潜在来源之一。

（三）茶叶中PAs风险评估由于PAs具有一定的肝毒性、肺毒性、遗传毒性、生殖毒性、致癌性、致突性[18]，国际食品法典委员会（CAC）和欧盟均采用了暴露边际（margin of exposure，MOE）法对其进行评估[19]。MOE的评估方法为：MOE=BMDL10/EDI，其中BMDL10为10%作用基准剂量置信下限；EDI为茶叶中PAs的每日摄入量（estimated daily intake，EDI），茶叶膳食量以10.46 g计，该茶叶膳食量为2013年国家食品安全风险评估中心通过非连续的“3天24小时”回顾方法，对我国9省（市）（北京市、黑龙江省、上海市、江西省、山东省、湖北省、广东省、贵州省、甘肃省）居民茶叶消费状况调查得出的结果。体重以60.6 kg计[20]，PAs含量以单一PAs的总和计，含量取值95%分位点，即EDI＝95%分位点值×。当MOE>10 000时，健康风险较低。目前欧盟和CAC分别制定了70μg/（kg bw·d）和237μg/（kg bw·d）的10%作用基准剂量置信下限（BMDL10）[21]，根据欧盟和CAC的BMDL10值来计算不同产区、不同季节和不同茶类的MOE风险结果见表5。从结果看，分别从整体、地区、季节和种类来评价，湖北省茶叶中的PAs健康风险较低。

表5 湖北茶叶中PAs风险评估结果

四、结论

本文采用采用UPLC－MS/MS分析了湖北省地区的茶叶中PAs污染情况，并通过MOE方法评价了其健康风险。结果表明，杂草和茶叶中PAs的检出率分别为79.2%和20.2%，PAs的总含量范围分别为1.86～2.67×104μg/kg和1.15～34.45μg/kg。比较茶叶种类发现，红茶中PAs的检出率最高，砖茶次之，绿茶最低；比较5个茶叶主产区的PAs检出率，PAs的检出率依次为宜昌、咸宁、大悟（恩施、英山地区的茶叶未检出PAs）；比较不同季节，依次为夏茶的检出率最高，春茶次之，秋茶最低。根据MOE结果判断，无论从产区、季节和种类角度评价，湖北省茶叶的PAs健康风险较低。通过茶园中杂草种类和PAs分析，发现杂草是茶叶中PAs的可能来源之一，但是其迁移途径和转化规律有待下一步研究。