miR-322-5p通过NOX4调控细胞凋亡抑制大鼠神经管畸形发生

黄琬淇，刘玉思，顾卉，袁正伟

（中国医科大学附属盛京医院，国家卫生健康委员会小儿先天畸形重点实验室，沈阳 110004）

神经管畸形（neural tube defects，NTDs）作为最严重的出生缺陷之一，全球发病率约为1‰～10‰［1］。由于神经管的闭合失败，可出现如无脑儿、脊柱裂、脑脊髓膜膨出等一系列表型［2］。神经上皮细胞的过度凋亡导致神经管闭合异常，产生NTDs［3］。全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）可通过诱导细胞凋亡活动影响神经管闭合，引起NTDs的发生［4-5］，本研究组前期利用ATRA成功制作了NTDs胎鼠模型。

微RNA（microRNAs，miRNA）是一种长度为22～24 nt的内源性小型非编码 RNA 分子，通过与靶基因的3’端非翻译区（3’untranslated regions，3’-UTR）结合，诱导mRNA降解或抑制翻译，从而调控靶基因的转录和表达［6］。miR-322是细胞增殖、分化、凋亡等生物学活动的重要调控因子，对于心血管系统、神经系统及其他器官均有一定的保护作用［7-8］。研究发现，miR-322-5p可抑制高糖诱导的小鼠神经干细胞凋亡和NTDs的发生。本课题组前期研究［9-10］发现，胚胎体外注射miR-322-5p-mimic，对NTDs有治疗作用。但它与ATRA诱导的大鼠NTDs的关系仍有待研究。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）是NADPH氧化酶家族的一个亚型成员，它的过表达可导致神经元的自身毒性以及大脑的局部缺血［11］。在高糖诱导的神经病变动物模型中，周围神经系统施旺细胞NOX4表达上调，促进细胞氧化应激参与周围神经损伤［12］。但NOX4在ATRA诱导的大鼠NTDs中的表达及作用尚未见报道。通过TargetScan及starBase生物信息学分析发现，NOX4是miR-322-5p的靶点，在NOX4mRNA的非翻译区存在miR-32-5p的潜在结合位点。本研究拟观察miR-322-5p与NOX4在ATRA诱导的大鼠NTDs模型中的表达及其对凋亡活动的影响，探讨NTDs的发生机制，以为其诊疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠神经干细胞（C17.2，贝纳创联生物研究所），ATRA（美国Sigma公司），MEM培养基（美国Gibco公司），MEM NEAA（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Gibco公司），青霉素链霉素溶液/双抗（美国Hyclone公 司），miR-322-5p mimics/inhibitor、mimics/inhibitor-NC（上海吉玛制药技术有限公司），NOX4 plasmid（上海吉凯基因化学技术有限公司）。JetPRIME（法国PolyPlus-transfection公司），miRNeasy Mini Kit（美国Qiagen公司），miRNA第一链cDNA合成试剂盒（上海生工生物工程有限公司），SYBR Premix Ex Taq Kit（大连宝生物工程有限公司），BCA蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），NOX4兔多克隆抗体（美国Rocklamd公司），Bcl-2鼠多克隆抗体（美国Sigma公司），Bax兔多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司），β-actin鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/抗小鼠IgG（美国Proteintech公司），UltraSensitive SP IHC kit、辣根过氧化氢DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠NTDs模型制备及组织样本收集：Wistar大鼠（北京华阜康生物技术有限公司）饲养于中国医科大学附属盛京医院SPF级实验动物房，按雌∶雄为2 ∶1于前一晚合笼，第二日早将大鼠分笼，阴道涂片见精子的雌鼠单独放于一笼，记为孕0 d（E0）。于E10将已孕雌性大鼠随机分为2组，NTDs组灌胃140 mg/kg橄榄油溶解的ATRA，对照组给予同体积的橄榄油灌胃。于E11剖宫取出胎鼠，获取脊髓组织。

1.2.2 免疫组织化学染色：将胚鼠脊髓固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋，制4 μm厚切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，于去离子水中水化。抗原修复后，使用UltraSensitive SP IHC试剂盒处理切片，滴加一抗anti-NOX4（1 ∶800），4 ℃孵育过夜，第二日DAB显色，苏木素复染，流水返蓝1 h除去余色，封片拍照。

1.2.3 免疫荧光染色：切片在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇脱水，去离子水水化，0.1% Triton X-100处理。动物血清封闭后，加入anti-NOX4抗体（1 ∶1 000），4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，室温荧光标记的二抗孵育（1 ∶200）2 h。DAPI染色，荧光显微镜观察。

1.2.4 细胞的培养和转染：用含10%胎牛血清、1%MEM NEAA、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的MEM培养液在37 ℃、5%CO2培养箱中培养小鼠神经干细胞C17.2。接种细胞至6孔板，转染前培养24 h。以JetPRIME为转染试剂，转染miRNA-空白对照（miRNC）、miR-322-5p mimic、miR-322-5p inhibitor以 及NOX4高表达质粒至C17.2细胞。

1.2.5 实时定量PCR：用miRNeasy Mini试剂盒从胚胎脊髓组织和C17.2中提取总RNA，用miRNA First Strand cDNA Synthesis反转录RNA。以U6为内参，用SYBR Premix Ex Taq试剂盒行实时定量PCR。引物序列如下：miR-322-5p F链为AGCAGCAATTCATGTTT TGGAA，R链为GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC；U6F链为CTCGCTTCGGCAGCACA，R链为AACGCT TCACGAATTTGCGT；β-actinF链为GGAGATTACTGC CCTGGCTCCTA，R链为GACTCATCGTACTCCTGCTT GCTG。

1.2.6 Western blotting：自胚胎脊髓和C17.2细胞中提取蛋白质。SDS-PAGE电泳分离，电转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h。加入一抗 NOX4（1 ∶1 000），Bax（1 ∶1 000），Bcl-2（1 ∶1 000），4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗膜3次（10 min/次），室温下与HRP兔和鼠二抗（1 ∶5 000）孵育2 h，ECL发光。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计分析，并用 GraphPad 8.0统计软件作图。计量资料以表示，采用独立样本t检验进行比较。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-322-5p和NOX4在大鼠NTDs形成中的表达

2.1.1 ATRA诱导的NTDs胎鼠脊髓组织神经管形态及NOX4定位表达情况：免疫组织化学染色和组织免疫荧光结果显示，NTDs组神经管形态明显异常，且胚胎脊髓中NOX4表达显著高于对照组，见图1。

图1 E11对照组和NTDs组大鼠胚胎脊髓组织神经管的形态和NOX4表达情况 ×200Fig.1 Morphology and NOX4 expression of spinal cord neural tube between E11 control and NTDs rats ×200

2.1.2 miR-322-5p和NOX4在NTDs胎鼠脊髓组织中的表达情况：实时定量PCR和Western blotting结果显示，与对照组相比，NTDs组脊髓组织中miR-322-5p mRNA和蛋白表达水平明显下调（均P＜ 0.05），见图2。提示miR-322-5p的表达对NTDs可能有抑制作用，而NOX4可能促进NTDs的形成。

图2 E11对照组和NTDs组大鼠胚胎脊髓组织miR-322-5p和NOX4表达情况Fig.2 Comprison of miR-322-5p mRNA and NOX4 protein expression in the embryonic rat spinal cord tissues between control and NTDs groups

2.2 ATRA致畸胎鼠脊髓中凋亡蛋白的表达情况

Western blotting结果显示，ATRA诱导的NTDs组中，NOX4蛋白表达显著上调，促凋亡蛋白Bax表达增强，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减弱（P＜ 0.05），见图3。表明NTDs胎鼠脊髓中细胞凋亡增加，提示NOX4可能促进凋亡的发生。

图3 凋亡相关蛋白在对照组和NTDs组胎鼠脊髓组织中的表达情况Fig.3 The expression of apoptosis-related proteins in the embryonic rat spinal cord of control and NTDs groups

2.3 miR-322-5p负调控NOX4的表达并减少细胞凋亡

2.3.1 转 染miR-322-5p mimics和inhibitor后C17.2神经干细胞中NOX4的表达：Western blotting结果显示，C17.2细胞中转染miR-322-5p mimic 48 h后，miR-322-5p表达水平显著上调（图4 A，P＜ 0.05），NOX4蛋白表达下调（图4B、4C，P＜ 0.05）；转染miR-322-5p inhibitor后，miR-322-5p表达水平下调（图4D，P＜0.05），NOX4表达下调（图4E、4F，P＜ 0.05）

图4 转染miR-322 mimic/inhibitor对C17.2细胞中NOX4表达的影响Fig.4 Regulation of NOX4 after transfection of miR-322 mimic/inhibitor

2.3.2 miR-322/NOX4对神经干细胞的凋亡的影响：Western blotting结果显示，转染NOX4高表达质粒的神经干细胞中，NOX4过表达，促凋亡基因Bax蛋白表达上调，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达下调。miR-322-5p mimic与NOX4过表达载体共转染细胞后，miR-322-5p mimic抑制NOX4表达的同时，也抑制了Bax表达，促进了Bcl-2表达（P＜ 0.05），见图5。提示miR-322-5p能够通过抑制NOX4表达抑制神经干细胞的凋亡。

图5 C17.2细胞转染miR-322-5p mimic和NOX4后NOX4和凋亡蛋白的表达水平Fig.5 Expression of NOX4 and apoptotic proteins after transfection miR-322-5p mimic and NOX4 of C17.2

3 讨论

NTDs作为一种多因素疾病，对于其发病机制的了解仍较局限。本研究利用ATRA诱导大鼠NTDs模型，发现NOX4作为miR-322-5p的靶标，可以通过参与细胞凋亡调控大鼠神经管闭合的过程，在大鼠NTDs发生中扮演重要角色。

细胞凋亡对于维持胚胎的正常发育具有重要作用，在神经管闭合进程中，中线细胞的过度凋亡导致神经管的闭合失败以及一系列NTDs表型的形成［13］。研究［14］发现，miRNA对NTDs具有调控作用。在高糖环境下，miR-129-2通过抑制细胞自噬可诱导NTDs发生［15］。本课题组前期研究［16］发现，孕产妇糖尿病或体外高血糖会增加miR-200b的水平，CITED2是miR-200b的靶标，被高糖下调。由此可见，miR-200b抑制剂可逆转培养的胚胎中高葡萄糖诱导的CITED2下调，内质网应激，进而改善胚胎发育中的NTDs。miR-322也参与了细胞凋亡活动的调控［17］。缺氧条件可引起心肌细胞出现凋亡，并伴随miR-322明显上调［18］。本研究组前期还发现miR-322-5p可以通过抑制TRAF3减少高糖诱导的神经干细胞凋亡［9］。但miR-322-5p是否参与ATRA诱导的大鼠NTDs尚无报道。

NOX4作为NOX酶家族成员是细胞超氧阴离子的来源，参与中枢神经系统的发育、神经干细胞生物学以及成熟神经元的功能［19］，并可通过产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）来诱导细胞发生氧化应激，进而导致细胞凋亡。研究［20-21］显示，糖皮质激素可通过NOX4/ROS/p38 MAPK途径诱导软骨细胞凋亡，心肌细胞NOX4高表达，凋亡也随之增加。由于神经元的抗氧化性较弱，ROS的产生是神经系统疾病和细胞凋亡的主要因素。NOX4对神经元的凋亡也具有相似作用，它参与大鼠缺血再灌注过程中ROS诱导的神经元凋亡和脑损伤［22］。此外，慢性氟暴露会诱导中枢神经系统发生氧化应激，诱导NOX4的表达，而NOX4高表达会导致血脑屏障损害，小胶质细胞活化和神经元丧失，从而导致脑功能受损［23］。但关于大鼠NTDs胚胎中脊髓NOX4的表达尚无研究。本研究结果显示，在NTDs胎鼠模型脊髓中，NOX4表达水平上调，且伴随促凋亡相关蛋白表达增加，抗凋亡相关蛋白减少。结合生物信息学分析的结果，NOX4是miR-322-5p的靶基因，当神经干细胞C17.2在转染NOX4高表达质粒的同时转染miR-322模拟物，可降低NOX4的表达水平，且伴随抗凋亡相关蛋白增加，促凋亡蛋白减少。由此可见，miR-322-5p能够抑制NOX4的表达，抑制神经管发育过程神经细胞的过度凋亡。

综上所述，miR-322-5p能够下调NOX4的表达，减少大鼠胚胎神经管闭合过程中细胞凋亡，减少NTDs的发生，因此，miR-322-5p可能成为NTDs治疗的新靶点。