美洲大蠊配方颗粒特征图谱方法建立

曾永祯，高 晗，孙福仁，田 方，李军山 ，2*

(1.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；2.楚雄神威施普瑞药物研究有限公司，云南 楚雄 675000)

美洲大蠊为蜚蠊科昆虫，俗称蜚蠊，又称蟑螂、偷油郎等，是一种十分古老的昆虫，最早以蜚蠊之名载于《神农本草经》[1]。现代药理研究表明美洲大蠊具有促血管增生、组织修复、强心升压、改善微循环、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎镇痛、增强免疫等作用[2-4]，并且以美洲大蠊药材为原料开发出了许多国家系列新药，如：康复新液、心脉龙注射液、肝龙胶囊等。

美洲大蠊主要含氨基酸类和核苷类成分。根据大量实验研究发现美洲大蠊中均含有17种以上氨基酸，其中包括7种必需氨基酸，2种半必须氨基酸和8种非必需氨基酸。核苷类有胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、次黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、肌苷、鸟苷等[5-7]。另外，美洲大蠊还含有蜚蠊酸、蟑螂油、过敏原成分、各种酶、细胞色素A、B、C、甲壳素、烟酸等。

近年来已有不少学者[8-10]，通过 HPLC或 UPLC法分析美洲大蠊药材及其产品，为快速高效评价其质量提供了参考依据。本实验采用HPLC法建立 3 批美洲大蠊配方颗粒的特征图谱，并标定了尿嘧啶、酪氨酸、次黄嘌呤、肌苷4个特征峰。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CPA225D电子分析天平(赛多利斯股份公司，德国)；KH-7200E超声波清洗器(昆山禾创超声波仪器有限公司)；LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津仪器设备有限公司)。

1.2 材料

美洲大蠊配方颗粒(云南神威施普瑞药业集团有限公司，批号：1906151、1907241、1907284)。对照品：尿嘧啶(批号：100469-201302)，酪氨酸(批号：140609-201914)，次黄嘌呤(批号：140661-201704)，肌苷(批号：140669-201606)，均为中国食品药品检定研究院提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和系统适用性实验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以体积比3%甲醇溶液(含0.1%冰醋酸)为流动相B，检测波长254 nm，流速1 mL·min-1，柱温30 ℃；以表1中的梯度洗脱条件进行检测，理论板数按肌苷峰计算应不低于5 000。

表1 流动相洗脱程序

2.2 对照品溶液的制备

称取酪氨酸、尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含尿嘧啶0.05 mg、酪氨酸0.08 mg、尿嘧啶0.05 mg、次黄嘌呤0.1 mg、肌苷0.1 mg的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品适量，研细，取约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入85%乙醇25 mL，称定重量，超声处理(功率150 W，频率40 kHz)1 h，放冷，再称定重量，用85%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液15 mL，水浴蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至10 mL量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 测定法

分别吸取对照品溶液、供试品溶液各5～10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。具体见图1。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取美洲大蠊配方颗粒，按照上述供试品溶液制备方法制备美洲大蠊配方颗粒供试品溶液，进样6次，结果各主要特征峰相对保留时间及相对峰面积的RSD为0.04%～2.48%之间，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 取美洲大蠊配方颗粒，按照上述供试品溶液制备方法制备美洲大蠊配方颗粒供试品溶液，分别于制备后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h时检测，结果各主要特征峰相对保留时间及相对峰面积的RSD为0.15%～1.70%之间，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.6.3 重复性试验 取美洲大蠊配方颗粒，按照上述供试品溶液制备方法制备美洲大蠊配方颗粒供试品溶液，依法测定，结果各主要特征峰相对保留时间及相对峰面积的RSD为0.13%～1.96%之间，表明方法重复性良好。

2.6 样品测定

取美洲大蠊配方颗粒适量，照“2.4”项下制备供试品溶液。另取尿嘧啶、酪氨酸、次黄嘌呤、肌苷对照品适量，照“2.3”项下方法制备对照品溶液。按上述色谱条件进样，记录尿嘧啶、酪氨酸、尿嘧啶、次黄嘌呤、肌苷保留时间，计算相对保留时间，结果见表2。

注：对照品溶液(A)(1：尿嘧啶 2：酪氨酸 3：次黄嘌呤 5：肌苷)。

注：美洲大蠊配方颗粒样品(B)。

表2 3批美洲大蠊配方颗粒特征图谱测定结果

由表2可知，美洲大蠊配方颗粒特征图谱有7个特征峰，与次黄嘌呤对照品参照物相对应的峰为S峰，计算相对保留时间，RSD<2.0%，故规定：其他特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围内，规定值为：0.74(峰1)、0.95(峰2)、1.05(峰4)、1.11(峰5)、1.24(峰6)、1.50(峰7)。

3 讨论

本实验对美洲大蠊配方颗粒样品进行全波长扫描，比较不同波长下色谱图的峰数目与分离效果。结果表明，在254 nm波长下美洲大蠊配方颗粒的峰数目较多且分离度良好，且溶剂峰影响小，因此将254 nm作为美洲大蠊配方颗粒特征图谱的检测波长。

本研究建立了美洲大蠊配方颗粒的特征图谱测定方法，并标定了尿嘧啶、酪氨酸、次黄嘌呤、肌苷4个特征峰，测定了3批美洲大蠊配方颗粒的特征图谱，方法科学、稳定、可靠。为美洲大蠊的产品提供了科学的评价指标，同时为完善美洲大蠊的质量标准奠定了良好的基础。