正交设计优选元胡止痛方乙醇提取工艺研究

于定荣，翁小刚，杜茂波，李 丽，刘 颖，陈 畅，王海林

(中国中医科学院 中药研究所，北京 100700)

元胡止痛方由延胡索加白芷组成，在临床上用于治疗气滞血瘀引起的多种疼痛，包括胃痛、肋痛及头痛等证。目前，研究报道中关于元胡止痛方的醇提取方法主要有超声提取法，如甲醇超声提取[1]、浓氨-甲醇超声提取[2]，回流提取法，如甲醇、乙醇回流提取[3-7]，但多集中在元胡止痛软胶囊、元胡止痛滴丸、元胡止痛片[8-9]等制剂的提取研究，而对元胡止痛方的提取报道较少。此外，2015版《中华人民共和国药典》中收录的元胡止痛方制剂如元胡止痛滴丸、元胡止痛软胶囊、元胡止痛口服液等制剂中采用的乙醇浓度各不相同，且均无明确的提取溶剂量。在查阅、分析元胡止痛方醇提取相关文献后，结合2015版《中华人民共和国药典》中元胡止痛方类制剂的提取工艺，并在前期元胡止痛方正交设计水提取工艺研究的基础上，本实验以乙醇浓度、加入溶剂体积、提取时间以及提取次数为考察因素，以正交设计对延胡止痛方进行乙醇提取工艺优选，通过建立HPLC法，采用梯度洗脱的同时测定方中药效成分延胡索乙素、欧前胡素2个指标的含量，通过加权法评判其最佳提取工艺条件，可为元胡止痛方的提取工艺及其工业化生产提供借鉴。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪(型号为LC-20AT，购于日本岛津)、二极管阵列检测器(SPD-M20A-型，购于日本岛津)；十万分之一天平(型号为ME155DU，购于瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 饮片

延胡索饮片购自聚药堂药业有限公司(河北省安国市，批号为1907004)；白芷饮片来源于同一公司，批号为1907002；符合 2015版《中华人民共和国药典：一部》延胡索、白芷饮片项下规定。将延胡索、白芷饮片以2∶1的量(延胡索∶白芷=2∶1)进行混合、粉碎，得其粗粉用于实验。

1.3 对照品

延胡索乙素对照品来源于曼思特生物科技有限公司(四川省成都市，批号为MUST-20032011，其纯度为99.86%)；欧前胡素来源于同一公司(批号为MUST-20031810，其纯度98.27%)。

1.4 试剂

甲醇为色谱纯，娃哈哈矿泉水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 因素及水平确定

在元胡止痛方的粉碎度、浸泡时间、过滤等条件相同的前提下，参考2015版《中华人民共和国药典》元胡止痛方类制剂的提取工艺以及相关研究报道，选择醇提浓度为60%、70%、80%；提取溶剂为药物的6倍量、8倍量、10倍量；提取时间为1.5 h、2.0 h、3.0 h；提取次数分别为1次、2次、3次[10]，正交设计见表1。

表1 L9(34)正交设计因素、水平

2.2 延胡索乙素及欧前胡素含量测定[1，11]

2.2.1 色谱条件 Inertsil©ODS-2型 (4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；流动相：甲醇(A)、0.1%磷酸水溶液(B)，通过梯度洗脱：(0～7 min，45%～55%A；7～9 min，55%～63%A；9～12 min，63%～64%A；12～20 min，64%～78%A)。进样量：10 μL；检测波长为235 nm，柱温为35 ℃，流速为0.8 mL·min-1。结果：延胡索乙素及欧前胡素二个色谱峰可完全分离，峰型良好，见图1-图4。

注：1.延胡索乙素；2.欧前胡素。

注：1.延胡索乙素。

注：2.欧前胡素。

注：1.延胡索乙素；2.欧前胡素。

2.2.2 供试品溶液的制备 取“1.2”项中的元胡止痛方粗粉，精密称定，得9个试验号，置于500 mL圆底烧瓶中，按表1中正交设计方案操作。分别加入不同体积、不同浓度的乙醇进行回流提取。将各次提取液以纱布过滤，滤液合并，定容，精密量取一定量滤液于蒸发皿中，以水浴浓缩，蒸干得浸膏。所得浸膏以甲醇溶解于5 mL量瓶中，定容至刻度，再以0.22 μm的滤膜进行过滤，得9个供试品溶液。

2.2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取7.28 mg延胡索乙素、5.42 mg欧前胡素置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，制备得延胡索乙素、欧前胡素对照品储备液。分别精密吸取延胡索乙素、欧前胡素对照品储备液适量，置于同一10 mL容量瓶中，加甲醇稀释，定容至刻度，即配制得混合对照品溶液(质量浓度：每1 mL含延胡索乙素291.2 μg、含欧前胡素162.6 μg)。

2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取延胡索乙素、欧前胡素混合对照品溶液2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、40 μL注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”项色谱条件测定。以各对照品的进样量为横坐标(μg)、峰面积为纵坐标(mAU)，分别绘制标准曲线，得延胡索乙素回归方程：Y1=2.0×106X+ 7 746，R2=0.999 9；欧前胡素回归方程：Y2=4.0×106X+ 5 478，R2=0.999 8。结果：延胡索乙素在0.582 4～11.648 μg，欧前胡素在0.325 2～6.504 μg，对照品的进样量与峰面积有良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取第2实验号样品供试品溶液(加8倍量60%的乙醇，提取2次，每次提取2 h)10 μL，按“2.2.1”项色谱条件连续进样 6 次，结果测得延胡索乙素的峰面积RSD为0.43%，欧前胡素的峰面积RSD为0.52%，仪器精密度良好。

2.2.6 供试品溶液测定 分别精密吸取9个供试品溶液，按“2.2.1”项分别进样，测定样品中延胡索乙素及欧前胡素的含量。见表2。

2.2.7 稳定性实验 取第2实验号样品供试品溶液，放置0 h，1 h，2 h，4 h，12 h、24 h，按“2.2.1”项测得延胡索乙素峰面积的RSD为0.99%，欧前胡素峰面积的RSD为1.02%，表明供试品溶液在测定的24 h内稳定。

2.2.8 重复性试验 按第2实验号方案，取“1.2”项同量的元胡止痛方粗粉6份，按“2.2.2”项中方法制备得供试品溶液，按“2.2.1”项条件，依法测得延胡索乙素峰面积的RSD为1.12%，欧前胡素峰面积的RSD为1.33%，表明方法重复性良好。

2.2.9 回收率实验 取“1.2项”相同量的元胡止痛方粗粉，精密称定9份，置250 mL圆底烧瓶中，按“2.1”项正交设计表中第1实验号方案，分别精密加入对照品适量，制备低、中、高质量浓度样品，按“2.2.1”项色谱条件，依法测定延胡索乙素、欧前胡素含量并计算回收率。结果延胡索乙素平均加样回收率为98.81%，RSD为1.39%；欧前胡素平均加样回收率为99.41%，RSD为1.84%。

2.3 结果

2.3.1 直观分析与方差分析 结果表明，4因素中A、B、C三因素均具有统计学意义，其中A(乙醇浓度)对提取效果有显著性影响(P<0.05)，故A选A3；而B(提取溶剂体积)、C(提取时间)对提取效果均有极显著性影响(P<0.01)；故B选B3；C选C3；而D(提取次数)无显著性差异，其水平可以任取，结合R值及生产实际，D选D2。各因素对实验结果的影响由大到小依次为：B>C>A>D；B、C及A起主要作用，而D影响较小。确定元胡止痛方醇提取的最佳方案为A3B3C3D2，即加10倍量的80%乙醇，回流提取2次，每次提取3 h。见表2、表3。

表2 L9(34)正交设计及延胡索乙素、欧前胡素含量加权评判结果

表3 延胡索乙素、欧前胡素含量测定方差分析结果

2.3.2 工艺验证实验 按“1.2” 项称取处方比例量元胡止痛方粗粉，共3份，按优选出的A3B3C3D2工艺条件重复实验，按“2.2.1”项分别测定延胡索乙素及欧前胡素的含量，经加权评判，测定得其平均含量分别为0.682 1%、0.682 3%、0.681 6%，高于正交设计表中其他实验号的平均含量，说明优选出的最佳乙醇提取工艺条件稳定、可行。见表4。

表4 正交实验验证结果

3 讨论

2015年版《中华人民共和国药典》中收录的元胡止痛口服液、元胡止痛颗粒的提取工艺以60%乙醇浸泡24 h再回流提取2次(第1次3 h，第2次2 h)，以延胡索乙素含量为其质控指标。元胡止痛片、元胡止痛滴丸的提取工艺与其相同，但在质控指标中增加了欧前胡素含量。而元胡止痛软胶囊的提取工艺则以80%乙醇浸泡12 h，再分别回流提取2次(每次2 h)，以延胡索乙素含量为其质控指标。可见，元胡止痛方类制剂的提取工艺中采用的乙醇浓度各不相同，且均无明确的提取溶剂量。目前的元胡止痛方研究报道也以元胡止痛滴丸、元胡止痛软胶囊、元胡止痛片等制剂的研究居多。

本实验以乙醇浓度、溶剂体积、提取时间及提取次数为考察因素，以HPLC法同时测定元胡止痛方中指标成分延胡索乙素、欧前胡素的含量，以加权法进行评判，通过正交设计优选出其最佳醇提工艺。考虑到元胡止痛方中延胡索为君药，白芷为臣药，故将延胡索乙素含量加权系数定为0.6，欧前胡素含量的加权系数定为0.4，通过综合评分公式Y=(延胡索乙素含量×0.6)+(欧前胡素含量×0.4)进行评判，并对其评判结果进行显著性分析[12]。这种采用多指标评价提取工艺的方式较采用单一的延胡索乙素或欧前胡素成分含量作为指标进行评价更科学、合理，也提高了质量控制标准。结果优选出元胡止痛方的最佳乙醇提取工艺条件为 A3B3C3D2，即将元胡止痛方以10倍量80%乙醇回流提取2次，每次3 h为最佳，三批工艺验证结果表明该工艺可行，稳定性好，可为元胡止痛方的工业化生产提供参考。