活血散结中药复方含药血浆对bFGF干预下兔RPE细胞Bax、Bcl-2表达的影响

蔡娅仙，罗 萍，彭 俊，3，李建超，彭 抿，吴权龙，3*，彭清华

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.长沙县星沙医院，湖南 长沙 413200；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；4.西安市中医医院，陕西 西安 710000)

由生物学理论可知，成纤维细胞生长因子存在不同的异构体，由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞分泌的bFGF就属于其中之一，它可在动脉硬化灶中起到促进内皮细胞游走及平滑肌细胞增殖的作用。另外，bFGF可促进新血管形成，修复损害的内皮细胞[1]。视网膜色素上皮细胞无再生能力，细胞死亡后不是被替换，而是邻近的细胞向侧面滑动，以填补死亡细胞遗留下来的空间，视网膜色素上皮细胞增生可能会导致增生性玻璃体视网膜病变(PVR)[2-3]。彭清华教授结合多年临床经验，运用具有活血化瘀、软坚散结功效之活血散结中药复方治疗PVR取得了较好疗效，可显著抑制增殖膜生长，改善眼部视力[4-7]，本研究通过体外细胞实验，对活血散结中药复方含药血浆[8]对bFGF干预下兔RPE细胞中Bax、Bcl-2蛋白的表达进行了探索，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择8只成年健康青紫蓝兔，无性别限制，体质量1.5～2 kg，实验动物提供方为上海市松江区动物实验中心，动物许可证号：SCXK(湘)2012-0008；选择10只成年家兔，无性别限制，体质量1.5～2 kg，由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(湘)2015-0004。所有实验动物不进行特殊喂养，与日常相同，将实验室内的温度控制在18～26 ℃，实验室内的空气处于流通状态，相对湿度应处于适宜含量，一般为55%左右。实验前行常规眼底检查(裂隙灯、间接眼底镜)，排除眼内外疾患后方可进入实验。实验前所有动物适应性饲养1周。

1.1.2 药品及试剂 活血散结中药复方由三七6 g、丹参15 g、鳖甲15 g等药品组成，饮片由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供，所选药材为同一批次，采用水煎法，分煎2次后混合药液浓缩至1.025 g/mL生药浓度，4 ℃下保存。bFGF(美国Sigma公司)；BGJ398(美国Selleck公司)；PBS缓冲液(湖南维世尔公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(南京凯基公司)。

1.1.3 实验仪器 CO2细胞培养箱(美国Thermo公司 3111)；生物安全柜(美国Thermo公司 1300)；倒置显微镜(德国Motic公司 AE31)；低速离心机(美国Thermo公司 Fresco 17)；酶标仪(美国Bio-tek公司 ELX800)；电泳仪(北京六一仪器厂DYY-6C)；扫描仪(日本Canon9000F MarkⅡ)；成像系统(上海Tanon Tanon-5200)。

1.2 方法

1.2.1 兔视网膜色素上皮细胞培养与鉴定 首先将青紫蓝兔处死，方法为耳缘静脉处空气栓塞法，可借助5 mL注射器，然后摘除眼球，须无菌操作，将角膜、晶状体及玻璃体去除，用PBS冲洗，一般须进行3次，采用酶消化法获取RPE原代细胞，将RPE细胞调整为(4～5)×104mL-1的密度，接种于25 mL培养瓶，在含5%CO2，湿度为90%的37 ℃培养箱中培养。当细胞贴壁铺满大部分瓶底即可进行传代培养。在新的含5 mL完全培养基的培养瓶中分配细胞悬液，一般以1∶2～1∶5的比例进行分配，按照(4～5)×104mL-1的密度传代培养。取对数生长期第2代细胞，采用Cytokeratin-8特异性抗体免疫荧光法在荧光显微镜下观察。

1.2.2 活血散结中药复方含药血浆制备 成年健康家兔10只，采用随机数字表法分为A组空白组、B组活血散结中药复方组，每组5只。根据人与家兔表面积换算方法计算(人以60 kg体质量为标准，家兔以1.6 kg体质量为标准)，活血散结中药复方组临床等效计量为5.064 g/(kg·d)。A组灌服蒸馏水，B组灌服活血散结中药复方，每日20 mL/kg，每日2次，共5 d。采血前禁食禁水12 h，末次给药2 h后，腹腔注射麻醉并将家兔固定后，取腹主动脉血于真空采血管内，颠倒混匀后静置、离心，收集上清液。

1.2.3 含药血浆对bFGF干预下兔RPE细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 实验分为正常血浆组、bFGF组、bFGF+BGJ398组、bFGF+含药血浆组，分别予以DMEM、正常血浆、bFGF(10μg·L-1)、bFGF(10 μg·L-1)+BGJ398(10 μg·L-1)、bFGF(10 μg·L-1)+活血散结中药复方含药血浆(10%)进行干预。根据不同分组的干预方式，加入相应干预因素，48 h后，收样进行Western blot检测，进行蛋白质定量后贮存于-80 ℃冰箱。制备PAGE胶，上样、电泳、转膜、膜封闭及抗体孵育后，行ECL化学发光检测，将胶片进行扫描，用图像分析软件IPP 6.0对图像进行灰度分析。

2 结果

Western blotting检测结果表明，bFGF组与正常血浆组比较，Bax蛋白的显影条带明显变淡，Bcl-2蛋白的显影明显增强，Bax/Bcl-2下调，差别均有显著统计学意义(P<0.01)；bFGF+BGJ398组、bFGF+含药血浆组与bFGF比较，Bax蛋白的显影条带明显增强，Bcl-2蛋白的显影明显变淡，Bax/Bcl-2上调，差别均有显著统计学意义(P<0.01)；bFGF+含药血浆组与bFGF+BGJ398组比较，蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1。

图1 蛋白表达

表1 含药血浆对bFGF干预下RPE细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

3 讨论

中医学对于增生性玻璃体视网膜病变无明确记载，其病因病机尚有待深入研究，根据该病特点，大致将其归类在“积聚”范畴，且隶属于中医眼科血证，具有眼科血证中出现的出血期、瘀血期、死血期、干血期的发展规律，又因PVR各阶段症状的差别，也可将增生性玻璃体视网膜病变划入“暴盲”及“视瞻昏渺”范围。临床研究表明，五脏六腑的功能失调、气血瘀滞、外部损伤均可导致视衣失养，根据患者疾病表现分为不同证型，如气血瘀滞型、痰湿内聚型等，至疾病后期，不同证型可出现相同的转归，可出现神膏衰损、痰结血瘀[8]。活血散结中药复方的临床功效为活血化瘀、软坚散结，对于增生性玻璃体视网膜病变可起到增强视功能的作用。

研究[9]表明，与PVR相关的FGF为bFGF，bFGF是最早发现的可刺激成纤维细胞生长的因子，在PVR形成中起关键作用，本实验用bFGF干预RPE细胞可有效模拟PVR体外模型。bFGF的功能通过位于细胞膜的酪氨酸激酶受体实现，酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)可有效抑制FGFRs活性[10]，其中，BGJ398(NVP-BGJ398)可高选择竞争性抑制FGFR2，本实验应用BGJ398作为活血散结中药复方阳性对照组对照性良好。Bcl-2是一种抑制细胞凋亡蛋白，Bax是促进细胞凋亡蛋白[11]。细胞凋亡与凋亡蛋白、促凋亡蛋白之间的构成比例紧密相关，这对“分子开关”决定了细胞凋亡的易感性[12]。当Bax形成同二聚体时细胞凋亡作用为主导，当Bax与Bcl-2形成异二聚体时以抑制细胞凋亡为主导作用[13]。本实验结果证明，bFGF对RPE细胞凋亡有显著抑制作用，可抑制Bax蛋白表达，促进Bcl-2蛋白表达。活血散结中药复方含药血浆可促进RPE细胞的凋亡，促进RPE细胞Bax蛋白表达及Bax/Bcl-2比率上调，抑制Bcl-2蛋白表达，且与抑制剂作用相当。

本实验采用体外培养RPE细胞增殖模型，成功建立了以RPE细胞增殖为首要因素的PVR体外细胞模型，通过Western blotting检测可见，活血散结中药复方促进PVR体外模型的RPE细胞凋亡可能是通过下调Bcl-2水平，上调Bax水平，抑制细胞分化，实现细胞凋亡，这可能是其治疗增生性玻璃体视网膜病的机制之一。