黔产玛咖氨基酸的含量测定及价值分析

杨卫灵， 杨 娜， 宋小娟， 张清海

(贵州医科大学 食品科学学院， 贵州 贵阳 550025)

引言

【研究意义】玛咖(LepidiummeyeniiWalp)为十字花科独行菜属一年生或两年生草本植物，原产于秘鲁安第斯山脉，从2002年开始引种国内，在云南、吉林、新疆、湖南、贵州等多地均有种植基地，2011年被卫生部批准为“新资源食品”[1-2]。玛咖含丰富的蛋白质、氨基酸、牛磺酸、矿物质、多糖等营养成分和玛咖烯、玛咖酰胺等生物碱活性成分[3-4]，具有“南美人参”的美誉，有抗疲劳、增强性功能、增强免疫力、抑制癌细胞、抗氧化、提高生育能力等功效[5-6]。玛咖兼具药用功效和营养价值，以其为原料的保健食品、食品日益增多。由于玛咖种植地域存在差异，品种不一，质量参差不齐，建立简便准确的氨基酸测定方法，对玛咖的鉴别、质量控制具有重要意义。【前人研究进展】目前，关于国内引种玛咖的研究产地主要为云南，也有少部分来自于新疆、四川、宁夏等地，多为活性成分的提取、鉴定、功能活性等研究，对于黔产玛咖氨基酸含量测定及组成分析鲜有报道。现代药理学研究表明，玛咖抗疲劳功效与支链氨基酸有关[7]，性功能与生育能力的提高则与精氨酸紧密相关[8]。氨基酸在人体代谢中具有非常重要的功能，如天冬氨酸(Asp)能缓解疲劳，能够增强肝功能；谷氨酸(Glu)通过合成谷氨酰胺，解除氨毒害，具有健脑益智作用[9]；Arg能增强免疫、增强性功能、促进胰岛素释放从而治疗糖尿病[10]；甘氨酸(Gly)具有抗炎、护肝、提高运动能力的作用[11]；蛋氨酸(Met)能预防脂肪肝[12]；亮氨酸(Leu)能促进胃液分泌；赖氨酸(Lys)是大脑神经细胞再生的第一限制性氨基酸，其缺乏影响大脑发育[13]。【研究切入点】明确黔产玛咖中氨基酸的含量及组成，对进一步研究其药理作用具有指导作用，为黔产玛咖的功效研究及新产品开发提供新思路。异硫氰酸苯酯(PITC)作为衍生化试剂，与一级、二级氨基酸均能发生反应，且不生成对氨基酸测定有干扰的副产物，所得产物苯基硫酸盐-氨基酸(PTC-AA)稳定性好。【拟解决的关键问题】采用异硫氰酸苯酯(PITC)为柱前衍生剂，RP-HPLC方法测定黔产玛咖中的氨基酸含量，并分析其氨基酸组成，为黔产玛咖氨基酸的测定及其应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 玛咖购自贵州威宁产地，异硫氰酸苯酯(PITC)、三乙胺(Bonna-Agela Technologies 公司)，正亮氨酸(Nle)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)对照品(北京索莱宝科技有限公司)；乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)；水为哇哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司，配置安捷伦色谱工作站、DAD检测器)，SK-1型快速混匀器(金坛市医药仪器厂)，101型恒温干燥箱(天津泰斯特公司)，AL-204电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，RV 8型旋转蒸发仪(德国IKA公司)，pH-3C型pH计(上海雷磁)。

1.2 溶液的制备

1.2.1 对照品 精密称取各氨基酸对照品适量，加0.1 mol/L盐酸溶液制成含天冬氨酸1.112 mg/mL、谷氨酸1.145 mg/mL、丝氨酸0.805 mg/mL、甘氨酸0.721 mg/mL、组氨酸0.785 mg/mL、精氨酸0.932 mg/mL、苏氨酸0.820 mg/mL、丙氨酸0.787 mg/mL、脯氨酸1.235 mg/mL、酪氨酸0.724 mg/mL、缬氨酸0.736 mg/mL、蛋氨酸0.751 mg/mL、半胱氨酸1.325 mg/mL、异亮氨酸1.147 mg/mL、亮氨酸0.818 mg/mL、苯丙氨酸0.668 mg/mL、赖氨酸0.735 mg/mL的混合对照品储备液。

1.2.2 供试品 精密称取过100目筛的玛咖样品约0.1 g，置聚四氟乙烯水解罐中，加入6 mol/L盐酸溶液10 mL，于恒温烘箱中115℃水解22 h，取出冷却，过滤于25 mL容量瓶中，用纯净水洗涤滤渣并定容至刻度。将溶液置于旋转蒸发仪上70℃浓缩近干，用纯净水溶解，将溶液转入10 mL容量瓶中，定容，即得。

1.3 柱前衍生化

精密移取对照品溶液、供试品溶液各200 μL，置2.0 mL玻璃离心管中，准确加入1.0 mg/mL正亮氨酸20 μL，再加入0.1 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，1 mol/L三乙胺乙腈溶液100 μL，混匀，40℃衍生化反应1 h，冷却至室温，加入正二氯甲烷500 μL，涡旋振荡混匀后，静置10 min，用注射器吸取上层溶液，经0.45 μm滤膜过滤后进样进行色谱分析。

1.4 方法学考察

分别吸取氨基酸对照品储备液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL于10 mL量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液定容至刻度，衍生化反应后进样测试，以质量浓度(mg/L)为横坐标x，氨基酸峰面积与正亮氨酸面积比值为纵坐标y，进行线性回归；并进行精密度、稳定性、重复性考察，方法回收率试验。

1.5 色谱条件

Hypersil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A为乙腈-0.1 mol/L乙酸钠溶液-乙酸(V:V：V=8︰92︰0.05)，流动相B为乙腈-水(V︰V=75︰25)，梯度洗脱(3～10 min，0～10%B；11～15 min，10%～22%B；16～30 min，22%～29%B；30～31 min，29%～60%B；31～40 min，60%～80%B)，进样量2 μL，流速1 mL/min，柱温35℃，检测波长254 nm。上述色谱条件下，色谱图见图1。

注：1～18分别为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸(内标)、苯丙氨酸、赖氨酸。A为氨基酸HPLC标准色谱；B图为黔产玛咖样品HPLC色谱。

2 结果与分析

2.1 方法学验证

仪器精密度RSD小于1.4%(n=6)；衍生化产物在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h内的稳定性除胱氨酸以外，其他氨基酸衍生物24 h稳定性RSD均小于3%，胱氨酸衍生物稳定性较差，需要在12 h内测定；玛咖样品重复处理然后进样测定，方法重现性RSD均小于5%(n=6)；对已知含量的玛咖样品中加入氨基酸对照品，进行样品处理、进样测试，17种氨基酸的平均回收率为91.3%～104.6%，RSD均小于5%(n=3)。表明，化合物在给定的浓度范围内线性关系良好，灵敏度高。

表1 17种氨基酸的线性关系

2.2 黔产玛咖的氨基酸组成

玛咖样品中，检出的氨基酸种类为17种，氨基酸总量达154.49 mg/g，Asp、Glu、Ser、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、Tyr、Val、Met、Cys、Ile、Leu、Phe和Lys的含量分别为3.29 mg/g、8.92 mg/g、4.60 mg/g、4.25 mg/g、2.30 mg/g、4.80 mg/g、21.57 mg/g、37.89 mg/g、39.37 mg/g、2.27 mg/g、0.97 mg/g、6.39 mg/g、1.18 mg/g、4.00 mg/g、3.53 mg/g、3.35 mg/g和5.81 mg/g。人体必需氨基酸Thr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Lys总含量达45.62 mg/g，占氨基酸总量的30.0%；Thr在必需氨基酸中的含量最高，占氨基酸总量的13.9%；Val的含量最低，占总氨基总量的0.62%。非必需氨基酸Pro含量最高，占氨基酸总量的25.5%；Cys最低，占氨基酸总量的0.76%。必需氨基酸与总氨基酸比值为29.5%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为41.9%。

2.3 黔产玛咖各类氨基酸含量

由表2可知，鲜味(Lys、Glu、Asp)、甜味(Gly、Ala、Ser、Thr、Pro、His)、苦味(Val、Leu、Ile、Met、Arg)3类呈味氨基酸中，甜味氨基酸含量高于鲜味类和苦味类氨基酸，占总氨基酸比例的69.7%，甜味类氨基酸能有效增强食物的口感，这为玛咖的食用性与产品开发提供了解释。玛咖的药效氨基酸(Asp、Glu、Arg、Gly、Phe、Tyr、Met、Leu、Lys)达42.61 mg/g，占总氨基酸的27.58%。玛咖支链氨基酸(Val、Ile、Leu)含量为8.5 mg/g，芳香族氨基酸(Phe、Tyr)含量为5.61 mg/g，支链氨基酸有提高运动能力、促进肌肉生长、生长激素释放[14]，芳香族氨基酸对食品的风味起着重要的作用。玛咖带正电荷极性氨基酸(His、Lys、Arg)的含量为12.91 mg/g，带负电荷极性氨基酸(Asp、Glu)为12.21 mg/g，具有高效杀菌作用的抗菌肽的形成与带电荷的氨基酸密切相关[15]，抗菌肽促进过氧化氢分解，降低自氧化速率和减少脂质过氧化氢含量，玛咖中脯氨酸和甘氨酸的含量达到77.26 mg/g，抗菌肽的形成与这两种氨基酸密切相关。

表2 黔产玛咖各类氨基酸的含量

2.4 黔产玛咖与其他药食两用植物的氨基酸组成及含量

由表3可知，与天麻、石斛、党参、肉苁蓉、黄芪、芡实、红枣、枸杞、山药、金银花10种广泛使用的药食两用植物比较[16-25]，黔产玛咖的总氨基酸及必需氨基酸的含量均高于天麻等10种植物；黔产玛咖药效氨基酸的含量高于石斛、党参、红枣、枸杞，低于天麻、肉苁蓉、黄芪、芡实、山药、金银花，分别为天麻、石斛、党参、肉苁蓉、黄芪、芡实、红枣、枸杞、山药、金银花药效氨基酸的0.60倍、1.72倍、1.30倍、0.93倍、0.97倍、0.61倍、2.28倍、1.00倍、0.93倍、0.65倍。

表3 黔产玛咖与其他药食两用植物的氨基酸组成与含量

3 讨论

3.1 衍生剂净化考察

为了保证样品能够充分反应，加入的异硫氰酸苯酯衍生化试剂的量应多余理论量，PITC试剂进入柱子后，导致柱子老化，缩短使用寿命，需要在进样前去除多余的PITC衍生化试剂。经典去除PITC的方法是用正己烷萃取法，正己烷的密度比较小，处于上层，用注射器取溶液时可能将上层溶液带入下层。在密度比水大的二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷中，二氯甲烷萃取后残余的PITC峰最小，且背景干扰得以改善。因此，最终选择二氯甲烷试剂作为净化试剂。

3.2 衍生样品稳定性考察

对氨基酸与PITC试剂衍生反应的产物在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h内进行稳定性考察试验表明，半胱氨酸衍生产物的稳定性在12 h以内测定结果的RSD在3%以内，但在24 h测定时，该峰峰面积大幅度减小。PITC衍生化的原理是氨基酸中的氨基与PITC反应生成苯胺酸硫甲酰衍生物，衍生产物的稳定性较高，但半胱氨酸为含硫氨基酸，结构式中含有一个巯基(-SH)活性基团，在空气中易被氧化，2个半胱氨酸巯基之间也会发生交联生成二硫键(-S-S-)而转变成胱氨酸。半胱氨酸衍生物的稳定性是否与其存在的巯基有关，需要进一步探索研究。

3.3 黔产玛咖氨基酸的组成与应用

WHO/FAO规定的理想蛋白质必需氨基酸与总氨基酸比值为40.0%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为60%[26]，黔产玛咖氨基酸的组成低于WHO/FAO规定的理想蛋白质比值，单一食用不利于人体吸收。黔产玛咖具有丰富的氨基酸组成，与天麻等10种药食两用植物对比分析，黔产玛咖的总氨基酸、必需氨基酸和药效氨基酸较为丰富，从中研发出更多的新型功能性食品，代替一些氨基酸的补充剂，更安全、绿色；玛咖抗疲劳、增强免疫能力、增强性功能等作用已有报道，这些功能与其中富含的药用氨基酸存在一定关系，与其他食品或者药材配伍生产新的保健食品。明确黔产玛咖氨基酸的组成含量及价值，以期对其质量控制提供参考依据，为药理学、药效学、蛋白组学进一步研究提供一定的理论数据，使人们更加清楚玛咖的功效作用，为玛咖的发展再寻找新出路。

4 结论

黔产玛咖中含有17种氨基酸，氨基酸总量为154.49 mg/g，高于常见的天麻、石斛、党参、肉苁蓉、黄芪、芡实、红枣、枸杞、山药、金银花等药食两用植物；必需氨基酸、药效氨基酸和甜味氨基酸含量分别为45.62 mg/g、42.61 mg/g和107.68 mg/g，分别占氨基酸总量的29.5%、69.7%和27.58%。与天麻等其他10种药食两用植物对比，黔产玛咖的总氨基酸、必需氨基酸和药效氨基酸较为丰富，黔产玛咖氨基酸种类齐全且含量丰富，具有较高的开发利用价值。未知领域的玛咖功效需要更深入研究，玛咖的特殊功效氨基酸在医疗保健食品领域具有广阔的开发前景。