杞菊地黄丸方对妊娠期高血压大鼠sFIt-1、PLGF水平及胎盘血管生成的影响*

魏艳玲， 黄景利, 李志强， 闫雪花， 张林西， 赵汗青

(1.河北北方学院附属第二医院 病理科, 河北 张家口 075100; 2.内蒙古赤峰市妇产医院 病理科, 内蒙古 赤峰 024000; 3.河北北方学院 病理教研室， 河北 张家口 075000)

妊娠期高血压主要表现高血压、蛋白尿及浮肿等临床症状，严重威胁孕妇和胎儿的健康[1]。研究发现，妊娠期高血压主要引起胎盘组织缺血、缺氧，导致机体的炎症和血管内皮功能障[2]。胎盘可溶性血管内皮生长因子-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFIt-1)、胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是影响胎盘血管形成的关键蛋白[3-4]。杞菊地黄丸方是由菊花、山茱萸、山药、泽泻、茯苓、熟地黄、枸杞和丹皮组成的复方制剂[5]，研究表明，杞菊地黄丸方能够有效降低血压、改善患者胰岛素抵抗，增加机体免疫功能[6]。在妊娠期高血压患者中，相对于常规治疗组，合并添加杞菊地黄丸方治疗组能够有效降低患者血压并改善患者肾功能[7]，但是有关杞菊地黄丸方对妊娠期高血压患者的的分子机制尚不完全清楚[8]。因此，本研究通过构建妊娠高血压大鼠，探究杞菊地黄丸方对妊娠高血压大鼠胎盘血管形成的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 SPF级SD大鼠，体质量200～220 g，购买于中国科学院实验动物研究所[许可证号SCXK(京)2019-0010]，适应性喂养1周，自由饮水，昼夜交替光照，温度维持在20～25 ℃，相对湿度60%～70%。

1.1.2实验试剂与仪器 注射用亚硝基左旋精氨酸甲酯(N’-Nitro-L-arginine-methyl ester hydrochloride，L-NAME)，逆转录试剂盒(广州锐博公司)，杞菊地黄丸方配方制剂(广东一方制药有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒(江苏碧云天公司)，sFIt-1一抗(美国Abcam公司)，PlGF一抗(美国Cell Signaling Technology公司)，VEGF一抗(武汉博士德公司)，HRP标记的鼠二抗、兔二抗(江苏碧云天公司)；多功能酶标仪(美国MD SpectraMax M3)，PCR仪器(赛默飞世尔科技公司)，显影仪(赛默飞世尔科技公司)；一抗和二抗稀释液(江苏碧云天公司)。

1.2 研究方法

1.2.1动物造模 制备受孕大鼠：将实验SD大鼠按照雌雄比例为1 ∶2合笼，于第2 天检查雌性SD大鼠阴道栓明确为孕鼠，若不能明确则采用阴道涂片显微镜下观察是否有精子，判定雌性SD大鼠是否妊娠。妊娠期高血压大鼠模型建立：将受孕SD雌性大鼠随机分为3组，即对照组、模型组及杞菊地黄丸方药物干预组(杞菊地黄丸方组)，每组各10只，模型组和杞菊地黄丸方组大鼠于受孕第13天时皮下注射L-NAME[125 mg(/kg·d)]，1次/d，共3 d]，构建妊娠高血压模型；对照组皮下注射等量的生理盐水。3组大鼠于受孕第10、15 及19 天时测量血压并进行24 h尿蛋白检测，第15 天大鼠血压较之前升高>20 mmHg、且尿蛋白阳性则表明造模成功。

1.2.2药物干预实验及标本 造模成功后杞菊地黄丸方组大鼠于第16～20天进行杞菊地黄丸方灌胃处理，杞菊地黄丸方配方组成：熟地黄24 g、茯苓9 g、枸杞9 g、山药12 g、菊花9 g、泽泻9 g、丹皮9 g、山茱萸12 g，加热煮沸、充分溶解，每付药均统一配置为168 mL。最后按照人与大鼠体积表面面积56 ∶1进行给药处理，灌胃剂量5 mL/d、2次/d，给药5 d。于第21天时采用戊巴比妥钠(10 g/L)腹腔麻醉孕鼠，并行剖宫产术，取出子宫和胎盘，将胎盘采用生理盐水冲洗干净后放置液氮罐内保存，备用。

1.2.3sFIt-1、PLGF及VEGFmRNA表达水平 采用实时荧光定量PCR检测，Trizol裂解法提取大鼠胎盘组织RNA，按照逆转录试剂盒将RNA逆转成cDNA，以cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR法检测3组大鼠sFIt-1、PLGF及VEGFmRNA表达。实验引物均有广州锐博公司设计合成反应体系和条件参考文献[3-4]。

1.2.4sFIt-1、PlGF及VEGF 蛋白表达水平 采用蛋白质免疫印迹(Wstern blot)法取大鼠胎盘组织剪碎，并使用PBS润洗1～2次，离心得组织沉淀物，加细胞组织裂解液(1 ∶5)冰上裂解1 h；高速离心机4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集胎盘组织上清液，采用BCA法蛋白质浓度定量检测；进行凝胶电泳(80 V、30 min后转为120 V)60 min(此时溴酚蓝指示电泳至凝胶最底层)，取出进行转膜，依据蛋白质指示marker和目的蛋白分子量大小进行切胶，湿转转膜法将目的蛋白转移至PVDF膜上，转膜时长约为2 h；采用5%的脱脂牛奶室温封闭2 h，孵育对应一抗sFIt-1(1 ∶1 000)，PlGF(1 ∶1 000)和VEGF(1 ∶1 000)4 ℃过夜；按照1 ∶5 000稀释比例，室温条件下孵育对应的二抗约1 h；摇床摇晃加入TPBS洗涤3次，5 min/次，加入显影液，显影并拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 杞菊地黄丸方对妊娠期大鼠血压影响

结果显示，妊娠第10 天时，3组大鼠收缩压、舒张压比较，差异无统计学意义(P>0.05)；妊娠第15 天时，模型组和杞菊地黄丸方组大鼠收缩压、舒张压均较对照组明显升高(P<0.01)；妊娠第19天时，杞菊地黄丸方组大鼠收缩压、舒张压均较模型组降低(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 各组妊娠期大鼠不同时点的血压变化Tab.1 Changes of blood pressure of pregnant rats in each

2.2 杞菊地黄丸方对妊娠期大鼠24 h尿蛋白的影响

结果显示，妊娠娠第10 天时，3组大鼠24 h尿蛋白含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；妊娠第15 天时，模型组和杞菊地黄丸方组大鼠24 h尿蛋白含量均较对照组明显升高(P<0.01)；妊娠第19天时，杞菊地黄丸方组大鼠24 h尿蛋白含量较模型组降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组妊娠期大鼠不同时点的24 h尿蛋白含量变化Tab.2 Comparison of 24 h urinary protein content of rats in each

2.3 杞菊地黄丸方对妊娠期大鼠sFIt-1、PLGF及VEGF mRNA表达水平的影响

结果显示，妊娠第21天时，与对照组比较，模型组大鼠胎盘组织sFIt-1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)，PLGF和VEGFmRNA表达水平明显降低(P<0.01)；与模型组比较，杞菊地黄丸方组大鼠胎盘组织sFIt-1 mRNA表达水平明显降低(P<0.01)，PLGF和VEGFmRNA表达水平明显升高(P<0.01)。见表3。

表3 各组妊娠期大鼠胎盘组织sFIt-1、PLGF和VEGF mRNA表达水平Tab.3 Expression levels of sFIt-1, PLGF, and VEGF mRNA in placental tissue of rats in each

2.4 杞菊地黄丸方对妊娠期大鼠sFIt-1、PLGF和VEGF蛋白表达水平的影响

结果显示，妊娠第21天时，与对照组比较，模型组大鼠胎盘组织sFIt-1蛋白表达水平明显升高(P<0.01)，PLGF和VEGF蛋白表达水平明显降低(P<0.01)；与模型组比较，杞菊地黄丸方组大鼠大鼠胎盘组织sFIt-1蛋白表达明显降低(P<0.01)，PLGF和VEGF蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。见表4和图1。

图1 各组大鼠胎盘组织sFIt-1、PLGF和VEGF蛋白表达Fig.1 Expression of sFIt-1, PLGF, and VEGF in placenta of rats in each group

表4 各组大鼠胎盘组织sFIt-1、PLGF和VEGF蛋白表达水平Tab.4 Expression level of sFIt-1, PLGF, and VEGF in placenta of rats in each group

3 讨论

杞菊地黄丸方最初出自《医级宝鉴》，原方为丸剂，多用于治疗肝肾精血不足；该方包含多味中药，具有多种功效，其中枸杞子具有甘平滋补肝肾精血，山药补益脾阴而固精，熟地黄滋肾补精，山茱萸温养肝肾精血，茯苓味淡平渗脾湿，菊花味苦微寒清胆明目，泽泻甘寒泄肾湿浊，牡丹皮辛苦凉泄肝火[9-10]。张兆康等[11]研究证实杞菊地黄颗粒能够抑制慢性高眼压大鼠视网膜细胞凋亡，从而改善大鼠视网膜病变。孙俊雄[12]研究发现杞菊地黄丸方联合拉贝洛尔片能够有效降低妊娠期高血压孕妇血压。因此，本研究初步通过构建妊娠期高血压大鼠探究杞菊地黄丸方对其血压和24 h尿蛋白的影响。结果发现，与对照组比较，模型组大鼠血压在第15 天和19 天时升高，同时伴随24 h尿蛋白含量增加。与模型组比较，给予杞菊地黄丸方药物干预能够有效降低大鼠血压以及24 h尿蛋白含量。提示杞菊地黄丸方对妊娠期高血压大鼠具有一定的治疗效果。

内皮细胞的功能异常是多种血管并发症的病理学基础。研究证实，妊娠期高血压患者血管内皮功能会发生明显的病变，导致内皮依赖性血管舒张和收缩功能的异常[13]。sFIt-1是一种分泌型二聚体糖蛋白，属于VEGF蛋白家族成员之一。其与内皮细胞表面受体FIT-1结合能够有效抑制VEGF信号相关通路，导致血管生成障碍并影响血管的通透性和完整性[14]。sFIt-1在血管内皮细胞、胎盘滋养层及平滑肌等多种细胞中高表达；能够抑制滋养层细胞的侵袭和分化。sFIt-1水平升高会导致血管生成异常，促使滋养层细胞侵袭不足，最终引起胎盘氧化应激，进一步促使sFIt-1分泌增加，导致血管内皮功能障碍，诱导妊娠期高血压形成[15-16]。PLGF同样是血管内皮生长因子家族蛋白成员之一，与受体结合能够激活受体自我磷酸化，并通过相应的酪氨酸蛋白激酶途径将信号传导进入细胞浆，发挥特有的生物学效应[17-18]。研究表明，PLGF能够诱导微血管内皮细胞增殖和迁移，调控内皮细胞生长[19]。另外，PLGF还可以刺激早期妊娠滋养层细胞DNA合成和细胞增殖。在妊娠期高血压疾病患者中，PLGF的表达显著降低，其机制可能与胎盘着床深浅相关[20]。滋养层细胞受损和母体血管转换异常是导致胎盘血管生成减少的主要因素，其可引发胎盘缺氧、滋养层细胞功能异常以及内皮细胞增殖障碍等与妊娠期高血压疾病的发生在发展密切相关[21-22]。以往研究均表明sFIt-1、PLGF和VEGF在妊娠期高血压疾病患者中发挥重要作用。本研究通过妊娠大鼠第16～20天灌胃杞菊地黄丸方，结果发现，与对照组大鼠比较，模型组大鼠胎盘组织sFIt-1 mRNA和蛋白表达明显升高，PLGF和VEGF mRNA及蛋白表达明显降低。与模型组大鼠比较，杞菊地黄丸方组大鼠胎盘组织sFIt-1 mRNA和蛋白表达明显降低，PLGF和VEGF mRNA及蛋白表达明显升高。以上研究结果初步证实杞菊地黄丸方可能通过影响sFIt-1/PLGF水平及胎盘血管生成改善妊娠期高血压大鼠血管病变。

综上所述，本研究明确了杞菊地黄丸方对妊娠期高血压大鼠的治疗效果，其作用机制可能涉及sFIt-1/PLGF水平和胎盘血管生成。但是本研究也存在一定的局限性，未对杞菊地黄丸方不同给药剂量进行研究。因此，在后续研究中将分析不同给药剂量的药理学作用，进而为临床杞菊地黄丸方治疗妊娠期高血压提供有效剂量参考。