颈动脉支架植入术后血清长链非编码RNA结直肠肿瘤差异表达基因水平及临床意义

李 爽， 王建民， 胡沛霖

急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者中约20%与颈动脉狭窄有关［1-2］，常引起头晕目眩，严重时甚至导致神经功能损伤和脑组织死亡［3-4］。常见因素有高血压、糖尿病等慢性疾病，造成脂质在颈动脉堆积，进而引发炎性反应，促使颈动脉内膜增厚，管腔变窄［5］。药物治疗和颈动脉内膜切除术为临床主要治疗手段，然而颈动脉内膜切除术创伤大、术后并发症多，不适用于老年AIS患者［6］。颈动脉支架植入术微创，在改善颈动脉狭窄性AIS患者脑组织灌注量方面取得较好疗效［7-8］，但术后仍有部分患者出现再次脑卒中或死亡［9］。早期评估术后患者预后情况并对危险因素进行干预是改善预后的重要手段。虽然目前部分血清学标志物如中性粒细胞与淋巴细胞比值及尿酸等，已用于预测AIS患者预后，但特异度较差，预测能力有限［10-11］。血管平滑肌细胞（VSMC）异常增殖、迁移可引起颈动脉内膜变厚、管腔变窄，导致AIS发生发展［12］。细胞实验表明，长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）结直肠肿瘤差异表达基因（colorectal neoplasia differentially expressed，CRNDE）敲除可抑制血小板衍生生长因子-BB诱导的VSMC增殖和迁移［13］。然而，有关LncRNA CRNDE在颈动脉狭窄性AIS中表达及其与预后的关系有待进一步研究。本研究旨在探讨颈动脉支架植入术后血清LncRNA CRNDE水平及其意义，以期为临床评估患者预后提供帮助。

1 材料与方法

1.1 一般资料

前瞻性选取2018年1月至2019年6月在邢台市人民医院接受颈动脉支架植入术治疗的173例颈动脉狭窄性AIS患者作为研究对象。AIS诊断依据《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》［14］标准。患者入组标准：①符合AIS诊断标准且DSA检查证实单侧或双侧颈动脉狭窄程度≥70%；②凝血功能正常；③无阿司匹林和氯吡格雷禁忌证；④年龄＞18周岁；⑤接受早期溶栓治疗；⑥签署知情同意书。排除标准：①严重心、肝、肾、肺功能障碍；②伴发颅内动脉瘤或动脉畸形、动静脉瘘等不能同时处理；③既往接受颅脑手术或颈动脉内膜切除术；④颈动脉钙化严重。173例患者中男105例，女68例；年龄39～78岁，平均（64.8±7.6）岁。本研究获邢台市人民医院医学伦理委员会批准（临床审2018-070）。

收集患者性别、年龄、饮酒史、吸烟史、基础疾病（高血压、糖尿病、高脂血症、冠心病）、脑卒中分布及脑卒中病灶数等资料。

1.2 血清学指标检测

抽取患者术后24 h内空腹外周静脉血10 mL，室温下4 000 r/min离心15 min，分离上层血清，置于-80℃冰箱。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测血清LncRNA CRNDE相对表达量。TRIzol试剂提取血清中总RNA，将2μg总RNA添加至20μL反应液中，采用TIANScript RT试剂盒逆转录合成cDNA，PCR扩增。反应条件为95℃5 min，95℃45 s，60℃45 s，72℃45 s，45个循环。LncRNA CRNDE正向：5'-GUGCUCGAGUGGUUUA AAUTT-3'，反 向：5'-AUUUAAACCACUCGAGCA CTT-3'；内参β-肌动蛋白（actin）正向：5’-GCUUA UCAGACUGAUUGA-3’，反向：5’-GTCAGTCGCT TGGGCTGT-3’。2-ΔΔCt表示LncRNA CRNDE相对表达量。

1.3 随访

采用电话或门诊等方式随访，复查患者出院后90 d内预后情况。采用改良Rankin量表（mRS）评分评估患者预后，mRS评分＜3分为预后良好，≥3分为预后不良。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。服从正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较用独立样本t检验。计数资料以例或率［n（%）］表示，用卡方检验。Logistic回归法分析影响颈动脉狭窄性AIS患者预后的相关因素。多因素logistic回归法建立模型A［出血转化＋脑卒中病灶数评估患者预后（F=－1.435＋0.468×出血转化＋0.374×脑卒中病灶数）、模型B［出血转化＋脑卒中病灶数＋LncRNA CRNDE评估患者预后（F=-8.454+0.828×出血转化-0.415×脑卒中病灶数+6.606×LncRNA CRNDE）。受试者工作特征曲线（ROC）分析LncRNA CRNDE、模型A、模型B评估患者预后的价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

173例颈动脉狭窄性AIS患者支架植入术后预后不良发生率为39.88%（69/173），其中死亡2例（1.16%），重度残疾14例（8.09%），中重度残疾20例（11.56%），中度残疾33例（19.08%）。预后不良组和预后良好组间患者年龄、性别、体质量指数、颈动脉扭曲、高脂血症、高血压、饮酒史、糖尿病、吸烟史、冠心病、发病部位比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；出血转化、脑卒中病灶数、同型半胱氨酸比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。预后不良组患者血清LncRNA CRNDE相对表达量为（1.35±0.34）%，高于预后良好组［（0.93±0.19）%］，差异有显著统计学意义（t=10.395，P＜0.001）。

表1 两组基线资料比较

将出血转化（无=0，有=1）、脑卒中病灶数（单发=0，多发=1）、同型半胱氨酸、LncRNA CRNDE作为自变量（α入=0.05，α出=0.1），颈动脉狭窄性AIS患者预后情况（预后良好=0，预后不良=1）作为因变量纳入logistic回归分析，结果显示出血转化、脑卒中病灶数、LncRNA CRNDE与颈动脉狭窄性AIS患者预后关系密切，见表2；LncRNA CRNDE与模型A评估AIS患者预后的ROC曲线下面积（AUC）差异无统计学意义（Z=1.043，P=0.297），模型B评估颈动脉狭窄性AIS患者预后的效能高于LncRNA CRNDE和模型A（Z=2.603，P=0.009；Z=2.945，P=0.003），见表3、图1。

表2 影响颈动脉狭窄性AIS患者支架植入术后预后的因素

表3 LncRNACRNDE、模型A及模型B评估颈动脉狭窄性AIS患者预后的效能

图1 LncRNA CRNDE、模型A及模型B评估颈动脉狭窄性AIS患者预后ROC曲线

3 讨论

LncRNA是主要存在于核内的一类新型非编码RNA［15］。已有研究证实多种lncRNA参与AIS发生发展过程［16-17］。LncRNA CRNDE在结直肠癌患者中差异表达，可调控染色质表观遗传，并具有调节组蛋白甲基化/非甲基化状态的作用，已在多种癌组织和癌细胞中发现其异常表达［18-19］。近来相关研究显示，LncRNA CRNDE在大鼠动脉球囊损伤后表达升高，并调节VSMC增殖、迁移和表型变化，而VSMC异常表达与颈动脉狭窄导致的AIS关系密切［13］。有关LncRNA CRNDE在颈动脉狭窄性AIS中表达及其与预后的关系有待进一步研究。

本研究在随访支架植入术后颈动脉狭窄性AIS患者预后情况中，比较不同预后患者血清LncRNA CRNDE相对表达量，结果发现预后不良组患者LncRNA CRNDE相对表达量高于预后良好组，表明LncRNA CRNDE可能与患者支架植入术后预后存在联系。为进一步明确血清LncRNA CRNDE与颈动脉狭窄性AIS患者预后的关系，通过logistic多因素分析影响患者预后的因素，结果显示出血转化、脑卒中病灶数与颈动脉狭窄性AIS患者预后关系密切，与既往研究相符［20-21］。此外，本研究还发现LncRNA CRNDE与颈动脉狭窄性AIS患者预后关系密切。

VSMC异常增殖、迁移可造成颈动脉狭窄并引起AIS［11］。VSMC是血管壁重要组成部分，主要在动脉血管中膜形成，具有构成血管壁组织结构和维持血管张力的作用［22］。VSMC有收缩型和合成型两种表型，正常情况下以收缩型存在，受到外界刺激后转化为合成型并分泌细胞基质金属蛋白酶、骨保护素及碱性磷酸酶等细胞因子，促进VSMC增殖、迁移，导致血管壁增厚、管腔狭窄，促进动脉粥样硬化发展［23］。动脉粥样硬化早期VSMC凋亡减少，导致血管内膜和中膜动脉血管中VSMC大量聚集，进而引起动脉粥样硬化性血管重构，加剧动脉粥样硬化发展［24］。基础研究表明，LncRNA CRNDE可抑制VSMC增殖、迁移，且LncRNA CRNDE基因敲除后可逆转VSMC表型改变［13］。因此本研究推测LncRNA CRNDE可能通过调节VSMC增殖、迁移参与颈动脉狭窄性AIS疾病进程。

本研究同时通过血清LncRNA CRNDE、模型A及模型B评估颈动脉狭窄性AIS患者预后的ROC曲线，结果发现模型B评估患者预后的效能高于LncRNA CRNDE及模型A，表明增加LncRNA CRNDE有助于评估患者预后。

综上所述，LncRNA CRNDE与颈动脉狭窄性AIS患者支架植入术后预后关系密切，检测血清LncRNA CRNDE表达有助于评估患者预后。本研究下一步将动态检测血清LncRNA CRNDE表达情况并进行基础研究，分析LncRNA CRNDE影响颈动脉狭窄性AIS患者支架植入术后预后的病理生理机制。