油茶烫伤膏对烫伤的疗效研究

陈玲霞，周子涵，宋 涛，谢 璐，陈水亲，刘志平，3

（1. 赣南医学院基础医学院；2. 赣南医学院2015级生物技术本科生；3. 赣南医学院炎症与免疫中心，江西 赣州 341000）

烫伤是最常见的皮肤损伤之一，在低收入国家烫伤致死率尤其高。它是临床常见热力烧伤的一种，是因热力、炽热金属、火焰、蒸气和高温气体等所致的体表组织损害，主要是皮肤损害，以中小面积Ⅱ度烫伤为主［1］。临床表现主要为红、肿、热、痛，损伤主要发生在皮肤、黏膜，治疗效果主要与病变范围和深度有关。长期以来，没有找到较为理想的治疗药物和方法，始终难以解决患者的疼痛、感染、结痂、留疤、植皮、致残等问题［2］。因此，寻找新的有效且不良反应小的药物或辅助用药成为当今研究热点。

油茶（Camellia oleifera）为我国特有的油料树种且资源丰富。茶油作为食用油无不良反应，被称为“东方的橄榄油”［3］，另外，茶油也一直用来治疗皮肤烧烫伤及红肿、发热、瘙痒等［4］。油茶籽经过压榨可获得茶枯饼，而茶枯饼提取物（Camellia cake extracts，CCEs）具有较高的应用价值。有研究表明茶枯饼中含量最丰富的化合物是茶皂素和多酚类化合物［5-6］，茶皂素又具有抗炎抑菌、抗氧化性、抗肿瘤、降血脂、美白等功效［7-10］。来源于茶枯饼的油茶皂苷具有保护心肌、抗肿瘤等作用［11-13］，在抗炎方面可能通过降低血清和血管壁细胞黏附分子（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表达来抑制烫伤导致的炎症［14］，YE Y 等研究发现油茶皂苷可能通过抑制促炎症细胞因子的产生从而控制小鼠皮肤炎症［15］。最近，我们的研究发现CCEs 具有通过抑制炎症细胞因子的表达和促进胶原蛋白的合成治疗小鼠烫伤，并且CCEs 对人体没有毒性［16］。这些研究提示CCEs 有抗皮肤炎症的作用，本文利用CCEs为原材料制备不同浓度的烫伤膏，研究其对小鼠烫伤创面的治疗作用，以期找到对烫伤创面愈合最佳的纯天然烫伤膏。

1 材料和方法

1.1 小鼠的来源C57BL/6 小鼠购于南京模式动物研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 烫伤膏处方组成CCEs 由赣南医学院药学院李洪亮课题组提供，CCEs 的来源及分析已在之前发表论文中详细描述［16］。我们将CCEs 的干粉溶解在30%甲醇中，并稀释至合适的浓度。使用Agilent 1290 UHPLC 串 联6230 ESI-TOF MS 系 统（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美国）进行CCEs提取混合物的分析，其代表性成分包括山茶苷A和B等。我们利用CCEs为原材料制备了5种烫伤膏（表1），具体成分如下：

表1 烫伤膏的种类及其配比

油脂型：凡士林（8009-03-8，西安天正药辅有限公司）40 g，蜂蜡（B9340，Solarbio）18 g，液体石蜡（8012-95-1，西安天正药辅有限公司）42 g，CCEs 50 mg。

水溶型：CCEs 1 g或2 g，PEG400（P8530，Solarbio）30.3 g，PEG4000（P8240，Solarbio）60.5 g，丙 二 醇（P7071，Solarbio）5 g，焦亚硫酸钠（CB04927309，成都华邑药用辅料制造有限责任公司）0.2 g，蒸馏水2 g，约制成100 g软膏。

O/W 型：硬脂酸（SS8520，Solarbio）6 g，硬脂醇（8005-44-5，西安天正药辅有限公司）6 g，凡士林6 g，液体石蜡9 g，司盘80（1338-43-8，陕西正一药用辅料有限公司）1.6 g，吐温80（9005-65-6，陕西正一药用辅料有限公司）4.4 g，甘油（G8190，Solarbio）10 g，羟苯乙酯（120-47-8，陕西正一药用辅料有限公司）0.2 g，CCEs 50 mg，丙二醇5 g，蒸馏水加至100 g。

W/O型：单硬脂酸甘油酯（30233-64-8，陕西正一药用辅料有限公司）12 g，蜂蜡5 g，凡士林5 g，液体石蜡30 g，司盘80 2 g，吐温80 1 g，羟苯乙酯0.2 g，CCEs 50 mg，丙二醇5 g，加蒸馏水至100 g。

1.2.2 烫伤模型的制备及分组取C57BL/6小鼠，体重18～20 g，用10%硫化钠脱毛，随机分为空白对照组、烫伤不处理组、烫伤后烫伤膏处理组、烫伤后尿素软膏处理组。将小鼠放在控制板上，俯卧位显示30%体表总面积。随后，用1.5 cm 空心塑料管垂直放置在小鼠的背部。一端与皮肤接触、从另一端倒入2 mL 100 ℃水浸泡25 s。造成深Ⅱ度烫伤（经病理切片证实）。

分组给药，烫伤后的小鼠单笼饲养，创面每2天换药1 次，共14 d。生理盐水冲洗后，各组外敷相应的烫伤膏，给药部位用无菌纱布缝扎固定。

1.3 观察项目

1.3.1 创面愈合率烫伤后第14 d 用透明硫酸纸描记创面，以此为模板，将质地均匀的硬纸板剪成同样大小，然后用电子天平称定重量，以重量代替面积，计算创伤愈合率。创伤愈合率=（原始烫伤面积－各时间点未愈合面积）/原始烫伤面积。

1.3.2 病理组织学观察烫伤后14 d 切取创面外缘皮肤，经福尔马林固定后，石蜡切片，进行HE 染色及胶原蛋白染色（索莱宝Masson 三色染色试剂盒）。

1.4 统计学方法统计学分析采用GraphPad Prism 8 软件。所有计量资料用均数±标准差表示，多组比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 烫伤膏的选择为了选择最佳烫伤膏，我们对已经构建好的烫伤模型进行药物治疗。共8 组，空白对照、烫伤不处理组、烫伤后尿素软膏处理组和烫伤后5种自制烫伤膏处理组。预实验结果显示烫伤不处理小鼠在第14 d 烫伤皮肤处开始出现增生肉芽组织，而尿素软膏、1#烫伤膏和2#烫伤膏治疗效果较好（图1）。后期我们选择1#烫伤膏和2#烫伤膏进行药膏治疗效果的评估。

图1 烫伤膏的治疗效果

2.2 各组创面愈合率的比较为了进一步研究1#和2#烫伤膏对烫伤的治疗效果，我们对烫伤不处理组、烫伤后尿素软膏处理组、烫伤后1#烫伤膏处理组和烫伤后2#烫伤膏处理组的创面愈合率进行计算。结果显示与烫伤不处理组相比，1#烫伤膏处理组的创面愈合率是0.91（F=5.3，P=0.009）；尿素软膏涂抹组的创面愈合率是0.87（F=5.3，P=0.039），差异均有统计学意义（P＜0.05）；2#烫伤膏处理组的创面愈合率（0.74）比烫伤不处理组（0.68）高，但差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。由于2#烫伤膏治疗烫伤的效果不显著，我们选择1#烫伤膏进行下一步研究。

图2 各组创伤愈合率比较

2.3 各组烫伤部位病理学观察为了研究油茶烫伤膏对小鼠烫伤的治疗作用机制，我们对小鼠烫伤部位分别使用1#烫伤膏、尿素软膏进行涂抹，对照小鼠含空白对照组和烫伤不处理组，第14 d 收集烫伤皮肤组织进行HE 染色和胶原蛋白染色。结果显示空白对照组各层结构完整，表皮层扁平整齐，毛囊和皮脂腺分布均匀；真皮中的胶原纤维束呈螺旋状，束间纵向排列整齐；真皮层组织及附属结构清晰可辨，细胞形态饱满；烫伤不处理组小鼠皮肤烫伤创面可见许多脱落的表皮细胞，细胞结构变形坏死，表皮层凹凸不平有纵向沟痕，真皮层与表皮界限不明，真皮层多数显空洞，细胞无序排列，胶原纤维束少且薄，排列无序，有些显断裂或点状；尿素软膏组小鼠皮肤表皮仍可见空隙或裂痕状，真皮层增厚，与烫伤不处理组相比，细胞形态要明显好转，真皮内胶原纤维束增厚，且排列整齐；1#烫伤膏组小鼠皮肤真皮层与表皮界限分明，毛囊、皮脂腺结构清晰可见，细胞形态恢复良好，胶原纤维束增厚明显，恢复接近正常水平（图3）。

图3 各组烫伤部位病理组织学观察

3 讨 论

烫伤在人群中的发病率约0.2%，且儿童患者超过1/3，损伤轻微则治愈率较高，但若损伤严重死亡率较高［17］。因此，如何有效地提高烧烫伤患者的创面愈合并降低死亡率仍是我们急需解决的问题。本文通过对不同类型烫伤膏的治疗效果比较，初期选择出烫伤愈合效果最好的水溶型软膏1#和2#用于后期的治疗效果检测，而水溶型软膏1#和2#的治愈效果良好可能跟烫伤膏的类型有关。油脂型烫伤膏中CCEs 溶解不充分且释药慢；W/O 或O/W 型乳膏剂不适用于有大量组织液渗出的创面，使用时会导致分泌物重新透入皮肤而使得创口恶化［18］。烧烫伤常导致皮肤屏障被破坏，大量组织液渗出、出血、创面糜烂［19］，而水溶型烫伤膏释药快且易洗除，能够吸收组织分泌液，非常适用于烧烫伤的治疗，但对皮肤的润滑、软化作用较差，后期可对该烫伤膏添加防腐剂和保湿剂进行优化。

实验动物烧烫伤模型相关的研究报道较多，如猪［20］、兔［21］、大鼠［22］、小鼠［23］的烫伤模型研究，建模所用的对象和方法多样，尚缺乏标准化的烫伤动物模型。目前采用的热水烫伤、蒸汽烫伤等方法常导致皮肤创面边缘不齐，烫伤面积和深度不易控制，重复性差［24］。本文采取热水烫伤建立了深Ⅱ烫伤模型，通过吸管引流，改善烫伤产生的一致性，减少组间差异，重复性较好。本实验通过对创伤愈合率的计算、烫伤部位HE 染色和胶原蛋白染色，评估自制烫伤膏对烫伤创面的治疗效果。烫伤不处理组小鼠表现为皮肤组织出现细胞结构变形坏死、胶原蛋白减少且严重被破坏等，而自制烫伤膏和尿素软膏的使用减轻了这些损伤。胶原蛋白是皮肤的主要组成成份，对皮肤损伤的恢复至关重要［25-26］，自制烫伤膏的使用逆转了胶原蛋白的减少，提示皮肤从损伤中恢复。而且烫伤膏的使用，促使了胶原蛋白的增生，与空白对照组相比，胶原纤维束更厚，可能是烫伤膏促使皮肤恢复的原因。烫伤膏可以促使胶原蛋白增生，可能是茶枯饼提取物的作用效果，但茶枯饼提取物的成分多，具体治疗烫伤的分子尚待研究。有研究表明茶枯饼提取物具有美白功效［27］，后期可用于美容产品的开发与利用。

烫伤后愈合过程，主要包括急性期炎性反应和组织修复细胞的作用［28］，它涉及炎症反应、细胞增殖、烫伤创面收缩、瘢痕形成及组织重塑等［29］。从皮肤组织病理学、胶原蛋白的形态和创面愈合率来看，自制烫伤膏不仅能有效地促进创面愈合，改善创面病理组织细胞结构，而且能有效地促进创面组织中胶原蛋白的合成和增加，促进创面组织的修复。烫伤膏改善创面愈合和促进创面修复的作用，可能与抑制炎性细胞因子、增加皮肤相关生长因子和细胞外基质表达的作用机制有关［30-31］。无论是抑制炎症、抑制细菌感染或者促进愈合修复等都还需更深入的研究，以开发出真正的纯天然烫伤膏用于皮肤损伤。