一测多评法测定金沙藤中异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素的含量

张道英，孙湘婷，陈树群，陶济明，刘 海

（赣南医学院药学院，江西 赣州 341000）

近年来随着中药研究的进一步发展，无论是消费者、制药公司、药品研发人员，还是国家药品监督管理部门都对中药质量提出了更高的要求。目前大部分中药是以单一成分的含量来评价产品的质量，然而中药所含成分比较复杂，仅以单一成分含量来评价中药产品质量不够全面准确。因此提出了多指标质量评价，但是传统的多指标质量评价需要众多中药对照品，对照品稀缺且提取成本昂贵。2006 年一测多评法（quantitative analysis of multicomponents by single-maker，QAMS）［1］的提出成功解决了这个问题。

本文主要研究中药材金沙藤，别名竹园荽、黑须草、牛斗茜等，它是海金沙科植物海金沙、小叶海金沙或曲轴海金沙的干燥地上部分［2］。在夏末秋初生长比较旺盛，该时间段为最佳采收期。金沙藤性凉，用途广泛，取鲜品捣烂后外敷可以治疗烫伤和黄蜂蛰伤，也可与滑石、蒲蓄、甘草梢联合使用治疗淋症［3］。此外有文献报道分别用金沙藤和海金沙做抗菌实验、抗炎实验以及镇痛实验，实验结果证实二者均有抗菌、抗炎和镇痛的作用［4］。金沙藤化学成分复杂，目前已经分离鉴定的化学成分就有十多种［5］，其中分离出的异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素四种化合物，均属于黄酮类化合物。异槲皮苷有着色、抗氧化的特性［6］，以其为原料可以合成食品添加剂；紫云英苷可作为纯天然抗氧化剂［7］，抗炎作用极强，有开发为抗乳腺炎药物的潜能［8］；槲皮素对多种癌细胞有抑制作用，能防癌抗癌［9］，同时对心脏也有保护作用；山奈素亦称“莰非醇”，能促进细胞对玉米葡糖的消耗，抑制乳腺癌MCF7 细胞增殖，有开发为治疗乳腺癌药物的潜能。

随着金沙藤被广泛应用于临床，目前关于金沙藤药材的化学成分、对机体的影响及其作用机制等方面的研究越来越多［10-13］，周艳林等［4］分离鉴定了金沙藤中的10种化学成分，并对其抗氧化活性进行了评价，建议对金沙藤药材进行质量标准研究时选择异槲皮苷作为对照品。因此，本实验以异槲皮苷为对照品，通过一测多评法测定金沙藤中异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素四种成分的含量。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料与试剂异槲皮苷［北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：2157-25-3（190711），纯度HPLC≥98%］，紫云英苷［北京世纪奥科生物技术有限 公 司，批 号：480-10-4（190514），纯 度HPLC≥98%］，槲皮素［北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：117-39-5（190715），纯度HPLC≥98%］，山奈素［北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：520-18-3（190710），纯度HPLC≥98%］，甲醇（色谱纯），甲酸（色谱纯），甲醇（分析纯），超纯水（自制）。

金沙藤药材分别在江西赣州、湖南长沙和四川宜宾三个产地购买，均由药学院生药学教研室李加林副教授鉴定为金沙藤正品。

1.2仪器高效液相色谱仪［岛津LC-15C，岛津LC-16C，岛津仪器（苏州）有限公司］，JP-100 超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司），B-260 恒温水浴锅（上海雅荣生化仪器设备有限公司），FA1104十万分之一分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），12S-FS1400 中药粉碎机（合肥荣事达小家电有限公司），Exceed-Ad-16艾柯实验室超纯水机（成都唐氏康宁科技发展有限公司），药典三号筛（浙江上虞市道墟张兴纱筛厂）。

2 方法与结果

2.1 方法原理中药成分虽然复杂，但是各有效成分间存在一定的比例关系，在进行多指标质量评价时，引入相对校正因子，通过测定其中一个代表性成分（价格低廉，容易提取，含量丰富）的含量，根据待测成分与代表性成分间的相对校正因子，计算待测成分的含量。

2.2 混合对照品溶液的制备分别在4 个25 mL的容量瓶中加入精密称取的11.05 mg、7.01 mg、4.12 mg、5.21 mg 异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素对照品，用甲醇定容，摇匀，即得上述四种成分的对照品溶液。

精密吸取异槲皮苷对照品溶液0.5 mL、紫云英苷对照品溶液0.5 mL、槲皮素对照品溶液0.2 mL和山奈素对照品溶液0.1 mL，并将全部溶液置于同一样品瓶中，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备取适量金沙藤药材（湖南长沙产），置于中药粉碎机中，粉碎成细粉，过三号药典筛，精密称定1.003 2 g，置于干燥的圆底烧瓶中，加入50 mL 纯甲醇，水浴回流2 h，放冷后过滤，收集续滤液，再过0.45 μm 的微孔滤膜，将滤液置于样品瓶中，贴好标签，备用。

2.4 色谱条件仪器：LC-15C 型高效液相色谱仪［岛津仪器（苏州）有限公司］；色谱柱：Agilent C18柱（规格150 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流动相：甲醇-0.3%甲酸，梯度洗脱，洗脱程序见表1，进样量：10 μL。（色谱图见图1，图2）。

表1 最佳的梯度洗脱程序

图1 混合对照品溶液的HPLC图

图2 金沙藤样品溶液的HPLC图

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察精密吸取混合对照品溶液，按“2.4”项的色谱条件连续进样6次，每次进样10 μL，记录峰面积，计算6 次进样后4 种成分异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素峰面积的相对标准偏差（RSD）值，4 种成分 的RSD 值分 别 为：2.71%、1.03%、1.44%、2.50%，表明仪器有良好的精密度。

2.5.2 重复性考察精密称取6 份同一批次的金沙藤粉末，每份约1.0 g，制备成6 份供试品溶液，按“2.4”项的色谱条件依次进样分析，根据色谱图中各成分的峰面积计算金沙藤中四种成分的含量以及RSD 值，四种成分的RSD 值分别为：1.28%、1.41%、3.27%、2.65%，表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性考察精密称取1.000 3 g 金沙藤粉末（湖南长沙产），制备成供试品溶液，按“2.4”项的色谱条件，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 进样，记录每次进样四种成分的峰面积，然后计算四种成分峰面积的RSD 值，RSD 值分别为1.13%、1.07%、1.99%、1.04%，表明供试品溶液在12 h 内具有良好的稳定性。

2.5.4 线性关系考察精密量取5 份混合对照品溶液，每份1 mL，将它们依次稀释1 倍、2 倍、3 倍、4倍、5 倍，将稀释好的溶液分别标记为1-1、1-2、1-3、1-4、1-5，按“2.4”项的色谱条件进样分析，每个浓度的溶液进样2次，每次进样10 μL，记录峰面积，取平均值。然后以峰面积为Y轴，进样量（μg）为X轴，绘制标准曲线，计算线性回归方程，见表2。表明四种成分的线性关系均良好。

表2 金沙藤中四种成分的线性关系

2.5.5 加样回收率实验精密称取5 份湖南长沙产的金沙藤粉末（1.000 2 g、1.001 3 g、1.000 2 g、1.000 3 g、1.000 1 g），加入与金沙藤粉末中四种成分等量的异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素对照品溶液，制备成供试品溶液，按“2.4”项的色谱条件依次进样10 μL，测定药材中四种成分的含量，计算回收率，结果见表3，表明该方法的准确度良好。

表3 金沙藤中4种成分的加样回收率实验结果

2.6 相对校正因子的计算结合线性关系考察时配制的5种不同浓度对照品溶液进样分析后所得色谱图，根据公式fsi＝fs/fi=（AS/wS）/（Ai/wi），分别计算异槲皮苷（简写s）和紫云英苷（简写z）、槲皮素（简写h）、山奈素（简写n）之间的相对校正因子fsi［14］（其中AS为异槲皮苷对照品峰面积，wS为异槲皮苷对照品的质量，Ai为某待测成分对照品峰面积，wi为某待测成分对照品的质量）。计算结果见表4。

表4 金沙藤中四种成分间相对校正因子的计算结果

2.7 相对校正因子的重现性考察

2.7.1 不同仪器对相对校正因子的影响考察岛津LC-15C、岛津LC-16C 两种仪器对相对校正因子的影响。取混合对照品溶液，使用上述两种仪器，各进样3次，记录四种成分的峰面积，计算相对校正因子fs/z、fs/h、fs/n及其相对校正因子的RSD 值，RSD 值分别为0.75%、3.14%、1.38%，表明不同仪器不会对相对校正因子产生显著影响。

2.7.2 不同色谱柱对相对校正因子的影响考察Agilent C18、Shimadzu C18、Waters C18三种色谱柱对相对校正因子的影响。取混合对照品溶液，分别使用上述三种色谱柱进样分析，记录四种成分的峰面积，计算相对校正因子fs/z、fs/h、fs/n及其校正因子的RSD 值，RSD 值分别为2.72%、0.71%、2.56%，表明不同色谱柱不会对相对校正因子产生显著影响。

2.7.3 不同柱温对相对校正因子的影响考察25 ℃、30 ℃、40 ℃三种柱温对相对校正因子的影响，取混合对照品溶液，分别按上述三种温度设置柱温，每种柱温条件下进样3次，记录四种成分的峰面积，计算相对校正因子fs/z、fs/h、fs/n及其相对校正因子的RSD 值，RSD 值分别为3.60%、1.74%、2.66%，表明不同柱温不会对相对校正因子产生显著影响。

2.7.4 不同流速对相对校正因子的影响考察0.6 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1三种流速对相对校正因子的影响，取混合对照品溶液，分别按上述三种设置流速，每种流速条件下进样3次，记录四种成分的峰面积，计算相对校正因子fs/z、fs/h、fs/n及其相对校正因子的RSD 值，RSD 值分别为0.79%、1.07%、1.04%，表明不同流速不会对相对校正因子产生显著影响。

2.8 待测成分色谱峰的定位在考察了不同仪器（岛津LC-15C、岛津LC-16C）、不同柱温（25 ℃、30 ℃、40 ℃）及不同流速（0.6 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1）对相对校正因子的影响，与此同时也记录了不同仪器、不同柱温及不同流速条件下待测组分与内参物的保留时间，内参物保留时间已知，根据待测组分与内参物的相对保留时间确定色谱峰的准确峰位置，见表5。

表5 待测组分与内参物相对保留时间

2.9 外标法与一测多评法测定结果的比较精密称取4 份金沙藤粉末（赣州赣江1.003 1 g、宜宾1.003 2 g、赣州李记1.002 5 g、长沙1.002 5 g），分别制备供试品溶液，按“2.4”项的色谱条件进样10 μL，记录四种成分峰面积。首先用外标法测定金沙藤中异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素的含量，然后再用一测多评法进行计算，结果见表6。为了验证一测多评法的准确性，将两种测定方法得到的结果用Pearson相关系数分析，结果两种方法之间的r为0.999 99，大于0.999 9，说明两种方法相关性很高，再对两种测定方法得到的结果进行t检验，P＞0.05，表明两组测定结果无显著性差异。

表6 一测多评法和外标法测定金沙藤中四种成分的含量/%

3 讨 论

3.1 从检验结果看，不论是用一测多评法还是用外标法测定金沙藤中四种有效成分的含量，结果并无显著性差异。表明“2.6”中计算得到相对校正因子可靠，在没有紫云英苷、槲皮素和山奈素对照品的情况下，利用异槲皮苷对照品以及相对校正因子可计算得到金沙藤药材中紫云英苷、槲皮素和山奈素的含量。

3.2 色谱峰的定位是否准确决定了实验的成败，根据相对保留时间或保留时间差值确定色谱峰的准确位置，是目前比较常用的方法，本实验根据四种成分之间的相对保留时间定位待测成分的色谱峰。3.3 一测多评法整合了内标、外标、校正因子等方法的优势，被越来越多地运用于中药质量评价和质量控制中。它弥补了单一指标质量评价和多指标质量评价的不足，但在一测多评法方法学的建立过程中，还有许多问题值得进一步探究。