肺动脉高压中NF-κB对IL-6表达的调控作用研究

侯微微，张少辉，刘 双

(1.河南科技大学第一附属医院呼吸与危重症医学科，河南 洛阳 471003；2.河南科技大学第一附属医院急诊科，河南 洛阳 471003；3.首都医科大学附属北京安贞医院学院/北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029)

肺动脉高压是一个复杂、多因素影响的疾病，其特征是肺动脉重构、肺血管阻力升高和右室肥厚[1-2]，但其机制尚不十分清楚。目前认为，免疫和炎症在肺动脉高压中起重要作用[3-4]，其中以巨噬细胞、白细胞介素-6(IL-6)及核因子κB(NF-κB)最为突出[5-7]。本研究旨在通过测定肺动脉高压大鼠肺组织IL-6及NF-κB水平，以及低氧刺激下不同时间段小鼠巨噬细胞IL-6和NF-κB的表达，探讨肺动脉高压中巨噬细胞内NF-κB对IL-6表达的调控作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1一般材料 本实验采用健康雄性Sprague-Dawley大鼠(无特定病原体)，鼠龄6周，体重200～240 g，购于中国军事医学科学院[许可证号：SCXK-(军)2007-004]。在首都医科大学附属北京安贞医院实验动物中心寄养，自由进食饮水，适应性饲养3～4 d后进行实验。实验人员已获得《北京市实验动物从业人员岗位证书》，动物饲养符合“北京市实验动物管理条例”和“实验动物福利伦理审查指南”。

1.2方法

1.2.1肺动脉高压模型建立与分组 选取体重200～240 g的健康雄性SD大鼠24只，随机分为对照组、4周组、6周组，每组各8只。对照组颈背部一次性皮下注射0.9%氯化钠溶液1 mL，饲养4周。配制野百合碱，首先溶于适量1 mol/L盐酸中，然后以0.1 mol/L氢氧化钠调节pH至7.4，最后用0.9%氯化钠液配置成终浓度为20 g/L的溶液。4周组、6周组给予颈背部皮下注射野百合碱(60 mg/kg)1次(注射液体量约为1 mL)，分别饲养4周、6周。实验动物均给予普通饮食，自由饮水。

1.2.2右心室测压 对照组、4周组、6周组大鼠均在注射生理盐水(或野百合碱)后28、42 d称重，应用戊巴比妥30 mg/kg麻醉后，由剑突下行腹部切口，将头皮针由腹腔经横膈膜插入右心室，用BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，测定右心室收缩压及平均压。

1.2.3计算右心肥厚指数 测压完成后经心尖取血，开胸取出心肺。分离心脏，剪去心房及大血管根部，参考JULIAN等[8]和MONGE等[9]介绍的方法，分离右心室和左心室加室间隔：沿房室沟剪去心房及大血管根部，沿室间隔分离右心室、左心室加室间隔，滤纸吸干水分后分别称重，计算右心室肥厚指数，判断右心室肥厚程度。

1.2.4组织标本的制备及指标的观察 肺组织切片后用10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，制作切片，行苏木精-伊红染色(HE染色)，光镜观察炎症细胞浸润，观察肺血管周围淋巴细胞浸润情况。行肺组织免疫组织化学染色，免疫组织化学过程分别选巨噬细胞CD68、IL-6及NF-κB一抗和相应的二抗做肺组织染色。观察染色情况。

1.2.5大鼠右肺组织IL-6和NF-κB的mRNA表达检测 将右肺组织从液氮中取出，应用Trizol液，按流程给予提取、分离、沉淀、洗涤、溶解RNA，测定RNA纯度良好，保存RNA。应用Promega-RNA逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA模板链。采用Primer 3.0设计实时聚合酶链式反应(RT-PCR)所用cDNA引物：NF-κB(大鼠)上游CACCAAAGACCCACCTCACC，下游CCGCATTCAAGTATAGTCCC；IL-6(大鼠)上游CCCACCAGGAACGAAAGTCA，下游GCGGAGAGAAACTTCATAGCTGTT。由生物公司(北京三博远志生物技术有限公司)进行引物合成。配置PCR反应液，进而给予两步法PCR扩增程序。目前基因表达采用比较CT值法。

1.2.6低氧诱导小鼠巨噬细胞中IL-6和NF-κB的mRNA表达检测 采用8周龄健康雄性C57BL/6小鼠胫骨股骨和髂骨分离巨噬细胞，培养5 d后种于6孔板中，缺氧时间分别为0、2、6、12、24、48 h。利用乏氧培养箱(37 ℃恒温箱内,持续通入94% N2、5%CO2、1%O2的混合气体)制造细胞缺氧环境，诱导巨噬细胞发生极化。收取上述诱导模型的细胞，应用同上RT-PCR方法测定IL-6及NF-κB的表达。其中，RT-PCR所用cDNA引物为：NF-κB(小鼠)上游CAACACTGCCGAGCTCAAGA，下游CGAGGCAGCTCC CAGAGTT；IL-6(小鼠)上游CTTCCATCCAGTTGCCTTCTTG，下游AATTAAGCCTCCGACTTGTGAAG。

2 结 果

2.1肺动脉高压模型建立 大鼠在注射野百合碱后第3周出现体毛暗淡无泽、反应迟钝、活动度下降，并且大鼠体重较此前下降，4周组大鼠在第25天死亡1只。第6周时部分大鼠出现呼吸急促，呼吸困难，喜站立，在第39、第41天共有2只大鼠死亡。死亡大鼠解剖后可见胸腔、腹腔积液。对照组、4周组、6周组的右心室收缩压及平均压逐渐升高，见表1。对照组、4周组、6周组大鼠右心肥厚指数逐渐升高，见表2。对照组、4周组、6周组大鼠右心室收缩压、平均压及右心肥厚指数均逐渐升高。4周组、6周组的右心室收缩压及平均压、右心肥厚指数均较对照组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；4周组与6周组上述数据比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2大鼠肺组织中炎症细胞及炎症细胞因子 显微镜下，野百合碱诱导肺动脉高压大鼠肺组织HE染色后，可见大量淋巴细胞浸润，特别在血管周围，尤其是外径大小相近的血管；4周组与6周组大鼠血管壁明显增厚(图1)。肺组织免疫组织化学染色后，可见巨噬细胞浸润增加(图2)，IL-6和NF-κB高表达，见图3～4。

表1 3组大鼠收缩压与平均压比较

表2 3组大鼠右心肥厚指数比较

A为对照组大鼠肺组织HE染色(400×)；B为4周组大鼠肺组织HE染色(400×)；C为6周组大鼠肺组织HE染色(400×)。

A为对照组巨噬细胞免疫组织化学染色(400×)；B为4周组巨噬细胞免疫组织化学染色(400×)；C为6周组巨噬细胞免疫组织化学染色(400×)。

A为对照组NF-κB免疫组织化学组化染色(400×)；B为4周组NF-κB免疫组织化学组化染色(400×)；C为6周组NF-κB免疫组织化学组化染色(400×)。

A为对照组IL-6免疫组织化学染色(400×)；B为4周组IL-6免疫组织化学染色(400×)；C为6周组IL-6免疫组织化学染色(400×)。

2.3肺组织RT-PCR检测IL-6和NF-κB表达水平情况 各组大鼠肺组织的RT-PCR结果提示：4周组、6周组肺组织NF-κB的mRNA表达均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；虽然6周组NF-κB的mRNA表达高于4周组，但2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。4周组、6周组肺组织IL-6的mRNA表达均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，但4周组、6周组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。IL-6和NF-κB的mRNA表达在各组大鼠中趋势相同。见图5～6。

图5 肺组织IL-6的mRNA表达图

图6 肺组织NF-κB的mRNA表达图

2.4低氧诱导小鼠巨噬细胞中IL-6和NF-κB的mRNA表达情况 采用相对定量RT-PCR对低氧条件下巨噬细胞IL-6和NF-κB的mRNA表达情况进行分析，结果表明，低氧时间分别为2、6、12、24、48 h的巨噬细胞其IL-6和NF-κB的mRNA表达均高于0 h，且其在各时间段内的表达趋势相同。见图7～8。

图7 低氧条件下不同时间点小鼠巨噬细胞的NF-κB的mRNA表达

图8 低氧条件下不同时间点小鼠巨噬细胞的IL-6的mRNA表达

3 讨 论

野百合碱是常用的肺动脉高压造模方法。目前研究认为大鼠一次性注射野百合碱2～3周后肺动脉血管就会发生纤维化、硬化，导致肺动脉血管管腔狭窄，血栓形成、阻塞等。第4周时即可出现肺动脉压力明显升高，右心室肥厚，同时出现肺动脉中膜增厚、肌化程度增加及内膜增生[10]。本研究中，注射野百合碱的4周组、6周组大鼠3周开始一般情况变差，4周后测右心室压力及右心肥厚指数均高于对照组，肺组织HE染色后可见4周组、6周组大鼠血管壁明显增厚，说明造模成功。

目前认为，炎性反应、基因突变、环境及代谢功能改变等均可能参与肺动脉高压的形成机制[11]。在肺动脉高压模型中，肺血管周围可见大量巨噬细胞浸润[12]。有研究发现，巨噬细胞在肺血管重建的起始和维持中起重要作用[13]。IL-6可由巨噬细胞分泌产生，而IL-6在肺动脉高压中明显高表达，并且可能与其预后相关[14]。NF-κB参与许多细胞因子及炎症细胞因子基因表达的转录调控，在炎性反应的细胞因子网络调节中起关键作用。NF-κB激活后，可启动和调控一系列参与炎性反应的炎症细胞因子的表达[15]。低氧性肺动脉高压大鼠实验中发现，肺组织的NF-κB表达增加[16]。在本研究中，野百合碱诱导肺动脉高压模型中可见巨噬细胞、NF-κB、IL-6表达增加，在该实验中NF-κB与IL-6的表达随大鼠肺高压的严重程度增加而增加，进一步说明两者在肺动脉高压中有重要作用。

NF-κB与IL-6之间存在密切关系，低氧增加IL-6的mRNA水平，其可能通过NF-κB/IL-6[17]通路发生。既往研究表明，C反应蛋白(CRP)的致动脉粥样硬化作用是通过激活NF-κB而介导的[18]。有研究完成了KF-κB途径介导CRP对肺动脉平滑肌细胞的促炎作用，证明CRP可能是激活人肺血管平滑肌细胞中NF-κB信号，介导IL-6表达，提示肺动脉高压过程中两者之间存在关系[19]。本实验中，肺动脉高压大鼠IL-6和NF-κB的表达趋势一致，也提示在肺动脉高压中NF-κB可能调控IL-6的表达。低氧条件下小鼠巨噬细胞内NF-κB与IL-6的mRNA表达一致，进一步提示NF-κB可能参与肺高压中巨噬细胞IL-6的表达调控。