中国首个卵巢组织冻存库冻存患者特征及冻存效果分析

金凤羽 阮祥燕 杜 娟 程姣姣 李扬璐 王虎生 谷牧青 鞠 蕊 杨 瑜 王月姣 许 新

(首都医科大学附属北京妇产医院内分泌科，北京 100026)

卵巢是女性重要的生殖内分泌器官，对于女性生殖能力和正常内分泌环境的维持具有重要意义，一旦受损或功能丧失，将严重影响女性的生活质量和身心健康。年轻女性癌症患者在治疗原发疾病的过程中，卵巢功能往往遭到严重的不可逆性损伤，导致患者卵巢功能早衰，失去生育能力。因此如何保护这些患者的生殖力在世界范围内备受学者关注。

卵巢组织冻存技术是保护女性生殖力的重要方法之一，具有独特的优势：①在一片组织中保存数百个甚至上千个不同成熟度的卵泡；②无须药物超促排卵，不会延误癌症的最佳治疗时间；③还能在一定程度上恢复卵巢内分泌功能[1-2]；④是青春期前女性或需要立即治疗的患者的唯一选择[3-4]。卵巢组织冻存技术在欧洲发达国家和地区已经广泛应用于临床，然而现阶段该技术在北京及周边地区仅首都医科大学附属北京妇产医院已经将其应用至临床，并成功对10例患者进行了卵巢组织冻存再移植[5]，其中一位患者实现了自然妊娠[6]，标志着该技术在我国临床应用过程中的零突破。然而仍然有相当大一部分患者及医务工作者对卵巢组织冻存这项技术并不了解，存在着诸多误解，导致大量需要卵巢组织冻存以保护生殖力的女性患者因对该技术不了解而错失良机。全面评估现阶段首都医科大学附属北京妇产医院卵巢组织冻存技术的临床应用情况，对于今后该技术在全国的大面积推广，使得更多患者能够有机会接触、了解并最终从中获益有着重要的参考意义。因此本研究首先对在首都医科大学附属北京妇产医院卵巢组织库进行冻存患者的疾病分布特点以及人口学资料进行统计分析，初步评估该技术的总体应用情况。然后对比部分患者新鲜组和冻存/复苏组卵泡活性计数的差异，全面验证该技术的有效性及稳定性。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组

将2016年9月至2021年4月于首都医科大学附属北京妇产医院人卵巢组织冻存库进行卵巢组织冻存以保护生殖力的患者共217例作为研究对象，收集其年龄、患病类型、地区、冻存前是否接受了放射治疗(以下简称放疗)及化学药物治疗(以下简称化疗)等情况进行数据统计分析。募集其中的46例患者并经过充分知情同意后，在冻存前取其卵巢组织的一部分进行相关研究。每位患者取4个卵巢皮质标本，采用数字表法随机选取其中2个新鲜标本到新鲜组进行卵泡活性计数，剩余的2个标本分到程序化冻存复苏组进行程序化冷冻/复苏后再进行卵泡活性计数。所有患者进行卵巢组织冻存前卵巢组织常规送病理，除外卵巢组织内肿瘤细胞转移。

1.2 卵巢标本制作

卵巢组织获取后按照标准化流程转运至人卵巢组织冻存库，由专业技术人员在无菌操作台上，4 ℃环境下使用无菌刀片去除卵巢髓质，仅保留卵巢皮质部分。同意进行卵泡活性对比研究的患者使用直径为 2 mm 的圆形Punch取材器另取其卵巢组织皮质标本，每人4个。

1.3 程序化冻存/复苏

本研究采用程序化冻存，具体冷冻方案参照2007年Isachenko V发表的相关论文[7]。患者的2个卵巢组织标本在4 ℃冻存液中平衡15 min后转移至含有1.8 mL冻存液的无菌冻存管内进行程序化冷冻。降温速度如下：由室温按照2 ℃/min的速度降至-6 ℃，在-6 ℃时进行人工诱导冰晶形成。然后按照0.5 ℃/min的速度继续降温至温度达到-40 ℃，最后按照50 ℃/min的速度迅速降至-140 ℃。冷冻完成后将无菌冻存管转移至-196 ℃液氮储罐中储存，7 d以后进行复苏。

复苏采用慢速复温法。冻存管从液氮罐取出后在37 ℃水浴箱中快速复温后至0 ℃左右，待冻存液大部分融化后将卵巢组织标本取出，置于含有不同浓度梯度复苏液的6孔板中逐步继续复温、洗涤。前45 min，每隔15 min更换到6孔板内下一个孔，每孔所含复苏液的浓度不同。后20 min每隔10 min更换一孔。整个复苏过程共更换5次孔位。

1.4 卵泡活性计数

根据钙黄绿素AM(Calcein AM)只能在活细胞中才能被代谢转化并产生荧光绿色这一特点，本研究使用Calcein AM对每位患者的2个新鲜卵巢组织标本和2个冻存/复苏后卵巢组织标本分别进行染色，再在495 nm荧光显微镜下进行卵泡活性计数。

1.5 试剂配制

冻存液：每100 mL冻存液内包含人血清白蛋白(IrvineScience公司，美国)5 mg，10%(体积分数)CryoSure-DMSO(WAK-Chemie Medical GmbH)5 mL和Leibovitz’s L-15(Gibco公司，美国)90 mL。

复苏液：每100 mL复苏液内含90 mL DPBS(Gibco公司,美国)和10 mL人血清白蛋白(IrvineScience公司，美国)。前3孔的复苏液内蔗糖含量分别为0.75 mol/L、0.45 mol/L、0.125 mol/L，后两孔复苏液内无蔗糖。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 卵巢组织冻存患者的年龄、地区分布及冻存前放疗及化疗比例

217例卵巢组织冷冻保存患者中年龄最小者1岁，最大者47岁，中位年龄32岁，P25和P75分别为27岁和35岁。在这些进行了卵巢组织冻存以保护生殖力的女性患者中以31～35岁为主，占总冻存人数的36.4%；小于25岁的人群所占比例最小，占总人数的19.4%；26～30岁之间及36岁以上的人群占比分别为25.3%和18.9%。

卵巢组织冻存的患者以北京地区为主，共116例，占总人数的53.5%，北京周边及外省患者共101例，占总人数的46.5%。冻存前接受过影响性腺功能的放疗和/或化疗的患者共计37例，占总人数的17.1%，未接受过相关治疗的患者共计180例，占总人数的82.9%。

2.2 卵巢组织冻存患者疾病种类及占比

217例进行卵巢组织冻存的患者中宫颈癌是主要患病类型，共计107例(49.31%)，其次是子宫内膜癌27例(12.44%)。按照所占比例下降方式排列依次为乳腺癌23例(10.60%,)，白血病12例(5.53%,)，卵巢肿瘤10例(4.61%)，骨髓增生异常综合征4例(1.84%)，霍奇金淋巴瘤4例(1.84%)，直肠癌3例(1.38%,)，膀胱癌2例(0.92%)，再生障碍性贫血2例(0.92%)，B细胞淋巴瘤2例(0.92%)，阴道癌2例(0.92%)，其他疾病包括脂肪肉瘤、子宫内膜异位症、范科尼贫血、血小板功能异常、异染性脑白质营养不良等共计19例(8.76%)(图1)。

图1 卵巢组织冻存患者疾病类型及所占比例Fig.1 The disease type and proportion of the patients with ovarian tissue cryopreservation MDS: myelodysplastic syndromes.

2.3 程序化冻存/复苏卵泡活性计数

46例同意进行卵巢组织活性计数对比研究的患者中年龄最小者16岁，最大者41岁，平均年龄(32.2±6.9)岁。新鲜卵巢组组的卵泡活性计数为59.04±78.067，冻存/复苏组卵泡活性计数为50.59±62.942，两组卵泡活性计数比较，冻存复苏组卵泡计数虽然在一定程度上有所减少，但差异无统计学意义(P>0.05),详见表1。两组卵泡活性检测典型图片见图2。

图2 新鲜卵巢组织与复苏后卵巢组织卵泡活性检测典型图片Fig.2 Typical pictures of follicular activity in the fresh and frozen-thawed ovarian tissue

表1 新鲜卵巢组织组和冻存/复苏组卵泡活性计数比较

3 讨论

卵巢组织冻存最佳适应证之一是乳腺癌。这是因为几乎在所有乳腺癌诊疗指南所推荐的辅助化疗方案中几乎都包含了环磷酰胺[8]，而环磷酰胺是一种生殖毒性最强的烷化剂之一，导致年轻女性术后的实际妊娠率不足5%[9]。因此，在欧洲最大的生殖力保护中心—FertiPROTEKT网络中心(包括德国、奥地利和瑞士等在内的85个中心)进行生殖力保护的4 060名妇女中，乳腺癌症患者高达41%[10]。然而，本研究却发现在本院进行卵巢组织冻存的患者就疾病类型而言，以宫颈癌为主，几乎占到所有冻存人数的一半，其次是子宫内膜癌，乳腺癌仅排第三。这一现象一方面与中国乳腺癌发病率低于欧美国家有关。另一方面与卵巢组织冻存技术在中国开展状况及认知程度有关。在中国能够进行专业地卵巢组织冻存生殖力保护的医院寥寥无几，而北京妇产医院已经成功地完成了中国首例冻存卵巢组织再移植手术，在接受卵巢组织再移植手术的10例患者中更是有一位已经自然妊娠[5-6,11-13]，这就决定了卵巢组织冻存技术的推广在某种程度上在北京及其周边地区是以北京妇产医院为中心向外扩展。在现有的推广模式下，了解和接受卵巢组织冻存技术相关信息最快、最完整的人群是妇产医院内部妇科肿瘤科的医护人员及需要进行生育力保护的妇科肿瘤患者。这部分患者以宫颈癌为主，导致了现阶段进行卵巢组织冻存的患者中宫颈癌占据了很大比例。宫颈癌患者虽然因为原发疾病需要全子宫切除或多次放疗，失去受孕的机会，但在原发病缓解之后进行卵巢组织再移植可以帮助患者恢复内分泌的功能，大大提高患者的生命质量，减少相关激素药物的使用，因此宫颈癌也是进行卵巢组织冻存的适应证之一。

在中国,人们对卵巢组织冻存技术普遍认知有限，具体表现在许多临床医生包括乳腺科医生本身认为保留生育能力与保命是相抵触的，抑或是生育能力的保留是可有可无的事情，持有无所谓的态度。部分冻存患者在进行卵巢组织冻存前已经接受了多次的放化疗，卵巢功能已经遭受一定程度的破坏，导致了大量年轻甚至于年幼需要生殖力保护的女性癌症患者失去生殖力保护的良机，或是保护效果欠佳，失去做母亲或者保留内分泌功能的最后机会。鉴于此种情况，医务人员可以借助宣传册、网络平台、科普讲座等方式，在全国范围内大力普及人卵巢组织冻存技术相关知识，帮助医务工作者意识到生殖力保护的必要性和可行性，让需要进行生殖力保护的年轻女性患者了解到还有一种新的选择和希望。

卵巢组织冻存是一种运用低温生物学原理从而达到冷冻保存卵巢组织的方法，在冻存过程中不可避免出现细胞内冰晶形成所带来的损伤和高溶液浓度导致的溶液损伤。目前，国际上大部分报道经过程序化冷冻/复苏后，卵巢组织内活性卵泡的存活率为70%～80%[13-14]，本研究对比了新鲜卵巢组织组和程序化冷冻/复苏后组卵巢组织内活性卵泡计数的变化，差异无统计学意义，再次证实了卵巢组织冻存技术能够有效地保存卵巢组织内的卵泡，与国际水平相似，能够为患者生殖力的有效保存及日后卵巢组织再移植后实现内分泌功能的恢复甚至妊娠意愿提供了必要的基础。

结论：北京妇产医院进行卵巢组织冻存人群的疾病类型主要是宫颈癌。卵巢组织冻存技术能够有效地保存患者的生育力。