复发性流产患者绒毛组织中血小板源性生长因子BB、诱导型一氧化氮合酶表达水平及与血管新生相关性

徐晓冬，高 云，曲冬颖

1.沈阳市第五人民医院 妇产科，辽宁 沈阳 110023；2.北部战区总医院 妇产科，辽宁 沈阳 110016

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指女性与同一性伴侣发生连续两次或两次以上的妊娠失败[1]，是不孕症中最重要的问题之一。RSA的发生可能由遗传或子宫问题、血栓形成、自身免疫性内分泌疾病、感染等引起[2]，但有约50%的RSA患者的发病机制尚不明确[3]。血管生成是妊娠成功的关键，这一通路的中断会导致各种不良妊娠结局，如RSA[4]。血小板源性生长因子BB(platelet derived growth factor BB，PDGF-BB)可通过调控血管内皮生长因子诱导的内皮细胞增殖来调节血管生成[5-6]，在RSA中发挥重要作用。诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)是调节血管生成的重要因子[7]，在正常妊娠中，iNOS参与排卵、着床、滋养细胞入侵、胚胎发育等[8]。有研究报道，iNOS因在血管生成中的作用而可能影响RSA[9]。本研究旨在探讨RSA患者绒毛组织中PDGF-BB、iNOS的表达水平及其与血管新生的相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将沈阳市第五人民医院自2014年1月至2019年1月收治的200例RSA患者纳入B组。纳入标准：年龄20～40岁；超过2次自然流产史；夫妻双方无染色体异常。排除标准：合并相关内科疾病。另将同期收治的200例行人工流产的正常早孕患者纳入A组。A组平均年龄(32.16±2.21)岁，平均孕周(10.65±1.67)周；B组平均年龄(32.87±2.56)岁，平均孕周(10.23±1.25)周。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。患者及其家属均签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 鼠抗人PDGF-BB单克隆抗体(北京鼎国生物技术公司)，兔抗iNOS多克隆抗体、兔抗CD105多克隆抗体、兔抗GAPDH多克隆抗体(美国Abcam公司)，裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白试剂盒(碧云天生物技术公司)，蛋白Marker、二抗(武汉博士得公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 Western Blot 将绒毛组织装入EP管，称重，置于冰上剪碎。按比例加入裂解液、蛋白酶抑制剂，混匀，超声细胞粉碎仪(JY-882N，宁波新艺生物公司)将管内组织打碎，置于4℃裂解30 min后，12 000 r/min、4℃离心30 min，保留上清液。根据BCA蛋白试剂盒说明书进行具体操作，100℃煮制蛋白5 min使蛋白变性，分装储存于-80℃备用。配制分离胶和浓缩胶，在配制胶的两端加入蛋白Maker作为标记，其余空白孔道中加入样品，根据测定的蛋白浓度等质量上样，电泳、跑胶、转膜。清洗后将膜用5% BSA封闭后置于37℃温箱中1 h，再分别加入iNOS一抗(1∶2 000)、PDGF-BB一抗(1∶1 000)、GAPDH一抗(1∶5 000)，4℃孵育过夜。复温后加入HRP标记的二抗(1∶5 000)，置于37℃温箱中孵育2 h。PVDF洗膜液中将膜清洗10 min，共3次。采用Bio-Rad Lab软件进行ECL发光，拍摄照片进行保存。通过灰度分析计算PDGF-BB、iNOS与对照GAPDH的比值。

1.3.2 免疫组化 4%甲醛溶液固定绒毛组织36 h，石蜡包埋、切片，采用S-P免疫组化两步法，DAB显色、脱水、透明和封片。然后对绒毛膜组织中的PDGF-BB、iNOS表达进行分析；CD105标记新生血管内皮，观察PDGF-BB、iNOS与微血管密度(microvessel density，MVD)的相关性。10×40倍显微镜下观察PDGF-BB、iNOS的表达，评分参照Fromowitz综合计分法[10]，除外阴性均视为阳性，阳性率计算方法参考文献[11]；MVD计数方法参考文献[12]。

2 结果

2.1 两组患者绒毛组织中PDGF-BB和iNOS蛋白表达水平比较 与A组比较，B组绒毛组织中PDGF-BB蛋白表达减少，iNOS蛋白表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 两组患者绒毛组织中PDGF-BB和iNOS蛋白表达水平比较

2.2 两组患者绒毛组织中PDGF-BB蛋白免疫组化染色结果比较 B组绒毛组织中PDGF-BB蛋白阳性率低于A组(34.0%比60.5%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 两组患者绒毛组织中PDGF-BB蛋白免疫组化染色结果(a.A组；b.B组；400倍)

2.3 两组患者绒毛组织中iNOS蛋白免疫组化染色结果比较 B组绒毛组织中iNOS蛋白阳性率高于A组(59.0%比36.0%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 两组患者绒毛组织中iNOS蛋白免疫组化染色结果(a.A组；b.B组；400倍)

2.4 两组患者绒毛组织中MVD比较 B组平均MVD低于A组[(25.77±4.98)比(39.68±5.39)]，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 PDGF-BB、iNOS与MVD相关性 A组、B组PDGF-BB与iNOS表达水平呈负相关(r=-0.689、-0.815，P<0.05)，PDGF-BB与MVD呈正相关(r=0.758、0.826，P<0.05)，iNOS与MVD呈负相关(r=-0.793、-0.861，P<0.05)。

3 讨论

在维持正常妊娠过程中，充足的新生血管是必不可少的[13]。因此，血管调控因子在妊娠期发挥着至关重要的作用。PDGF-BB是一种促进血管生成的生长因子，可以刺激内皮细胞形成新生的血管网络，稳定血管发育。PDGF-BB存在于子宫内膜的管腔上皮、子宫间质、子宫腺体和子宫内膜的血管，其表达下降会导致小鼠周细胞数量减少、滋养细胞减少、血管明显扩张、水肿，甚至胚胎死亡。PDGF-BB及其血管生成受体参与组织重构，并作为炎症反应的传播者和效应器发挥作用。PDGF-BB还是调控胚胎着床部位的子宫内膜间质细胞运动因子之一[14]。在有氧环境中，iNOS被诱导表达，产生过量的一氧化氮与超氧化物发生反应，导致过氧亚硝酸盐的形成，并产生细胞毒性。在病理条件下生成的一氧化氮能够减少输卵管运动，引起子宫肌纤维收缩，从而导致流产[15]。有研究报道，PDGF-BB能够通过诱导ERK1/2激活而抑制iNOS表达[16]。

MVD是衡量血管生成的定量指标。CD105作为标记血管新生的特异性标志物，明显区别于泛血管内皮细胞标志物的特征是其仅在增殖活跃的血管内皮细胞上呈强表达。有研究报道，在妊娠早期胚胎发育和胎盘处于相对缺氧的环境中时，缺氧诱导因子-lα被激活，并诱导下游靶基因PDGF-BB转录和翻译，从而参与胎盘滋养细胞浸润和绒毛血管发育；而在稽留流产的绒毛组织中，PDGF-BB表达降低，导致绒毛血管结构发育不良、血管生成受阻、血管数目减少和形态异常、血管渗透性增加，使胎儿胎盘单位灌注不足，胚胎缺血缺氧，从而导致流产[11，17]。Nanaev等[18]研究表明，在妊娠豚鼠胎盘血管附近的滋养细胞中有iNOS表达，该细胞可以破坏血管壁，导致血管生成减少，进而引起不良妊娠，导致流产。

综上所述，RSA患者绒毛组织中PDGF-BB和iNOS的异常表达使胎盘血管新生受限，影响胚胎发育，导致流产。