丹参酮ⅡA在低氧诱导肺动脉高压中的保护作用

刘礼姣，邱庆竹，郑均敏，谢利剑

(上海交通大学附属儿童医院，上海市儿童医院，上海 200062)

肺动脉高压(PAH)是一种病因复杂、高致死性进行性的心血管疾病，主要表现为逐渐升高的肺动脉压力，最终可导致肺血管重构、右心室肥大和功能衰竭，甚至死亡[1]。肺动脉细胞尤其是肺动脉平滑肌细胞(pulmo-nary aterial smooth muscle cells，PASMCs)无序增殖增加和凋亡减少引起的肺血管重塑是PAH发生发展的重要病理基础[2]。目前，临床上广泛应用的靶向药物治疗，如前列环素类、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂等不能从根本上逆转肺血管重构，对PAH的疗效并不理想，因此，关于PAH的临床诊治依然极具挑战性。

丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA，TanⅡA)是丹参中含量丰富的脂溶性活性药理成分，具有扩张冠状动脉血管、改善微循环、保护心脏、减少和清除血小板聚集、增强机体抗缺氧能力、拮抗脂质过氧化和清除自由基等重要作用。研究[3-5]发现，Tan Ⅱ A通过促进肿瘤细胞凋亡及影响其自噬与增殖发挥良好的抗肿瘤活性。Tan Ⅱ A通过降低细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P27蛋白降解，使细胞周期停止在G0/G1期，抑制PASMCs增殖，但Tan Ⅱ A对PASMCs自噬与凋亡的影响目前尚不明确[6]。研究[7]显示，经典的抗凋亡通路磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol-3-kinase/Akt，PI3K/Akt)在自噬中也发挥着重要调控作用。因此，本研究通过建立低氧诱导PAH小鼠及细胞模型，分析TanⅡA对PAH的治疗作用，并初步探讨TanⅡA对低氧诱导的PAH中PI3K/Akt信号通路及自噬和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

C57BL6雄性小鼠15只(8周龄，体质量22～25 g，上海SLAC实验动物有限公司)，TanⅡA(10 mg，纯度≥97%，美国Sigma，加入1 mL二甲基亚砜将其充分溶解，配制成浓度为10 mg/mL的原液)，二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma)，BCA蛋白浓度检测试剂盒(北京BLKW Biotechnology)，RIPA裂解液、总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性检测试剂盒、脂质氧化(MDA)检测试剂盒(上海碧云天生物技术公司)，常压低氧实验箱(长沙长锦科技有限公司)，测氧仪(浙江建德电化学仪器厂)，PowerLab Systerm电生理信号采集仪、聚乙烯导管(AD Instruments 公司)，人肺动脉平滑肌细胞(hPASMCs，美国Sciencell)，平滑肌细胞培养基、平滑肌细胞生长因子、青霉素/链霉素溶液(双抗，美国Sciencell)，胎牛血清(北京Solarbio)，无酚红细胞培养基(DMEM，美国Gibco)，胰蛋白酶消化液(北京Solarbio)，聚丙烯酰胺凝胶预混液(上海碧云天生物技术公司)，预染蛋白Marker(美国Thermo Fisher)，Loading Buffer及ECL化学发光试剂盒(新赛美生物科技公司)，兔抗鼠磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体(英国CST)，兔抗鼠Bax多克隆抗体(一抗，美国Proteintech Group)，兔抗鼠P62抗体(一抗，美国CST公司)，兔抗鼠Akt抗体(一抗)及兔抗鼠磷酸化Akt(Phosphorylated-Akt，P-Akt)抗体(一抗，美国CST公司)，辣根过氧化酶标记二抗(山羊抗兔，英国CST公司)，二氧化碳培养箱(日本SANYO)，三气培养箱(美国Thermo Scientific)。

1.2 实验方法

1.2.1 低氧动物模型建立及分组 取15只8周龄C57BL6雄性小鼠，体质量22～25 g，适应性饲养1周后，随机分为3组：常氧组(n=5)、低氧组(n=5)和低氧+TanⅡA组(n=5)。常氧组呼吸正常空气，低氧组和低氧+TanⅡA组置于常压低氧箱内，采用测氧仪监测使箱内氧浓度维持在10.0%±0.5%，石灰钠和无水氯化钙吸收箱内过量的CO2及水蒸气，将CO2浓度控制在0.5%以内，每天低氧24 h，连续2周。2周后低氧+TanⅡA组每天腹腔注射TanⅡA 10 mg/(kg·d)，其他两组小鼠腹腔注射磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，连续2周，2周中低氧组和低氧+TanⅡA组继续置于低氧环境中，在4周造模过程中3组小鼠均置于同一房间内，饲养条件相同，每天均自由进食及饮水。

1.2.2 小鼠右心室压力测定、取材及肺组织病理学观察 4周造模结束后称量小鼠质量，腹腔注射1%戊巴比妥钠(10 μL/g)使小鼠麻醉，待其进入麻醉状态后，取仰卧位用细线固定四肢及门牙在解剖台上，颈部皮肤消毒后进行颈部正中切口，逐层钝性分离肌肉、结缔组织，游离右侧颈外静脉，结扎远心端，动脉夹夹闭近心端，用聚乙烯导管(导管内充满0.5%肝素溶液，抗凝血)行右侧颈外静脉插管术，固定导管，导管另一端经压力换能器与Power Lab 电生理信号采集仪相连，记录右心室收缩压(RVSP)。测压结束后，对小鼠胸腹部皮肤消毒，迅速打开胸腔，充分暴露心、肺等脏器，取装有适量磷酸盐缓冲溶液(PBS)的5 mL注射器，用针头迅速刺入右心室，缓慢注入PBS进行灌流，然后小心分离心、肺。其中右肺放置于无酶冻存管中后立即置于液氮罐内快速冷却，随后置于-80 ℃低温冰箱内保存，用于后续检测实验，左肺以4%甲醛溶液固定24 h后，行病理切片及苏木精伊红染色法(HE)染色。

1.2.3 小鼠肺组织中氧化应激相关产物检测 取-80 ℃低温冰箱中冷冻备用的肺组织适量，采用预冷生理盐水冲洗除去血液，吸水纸吸干称质量后迅速置于1.5 mL无菌EP管中，加入适量RIPA裂解液(肺组织质量占裂解液比例为10%)，采用超声波细胞破碎仪充分磨碎后再静置裂解10 min(以上操作均在冰上进行)，10 min后10%肺组织匀浆于4 ℃离心，12 000 r/min，离心10 min，然后取上清液并转移至新标记好的1.5 mL EP管内，采用BCA蛋白检测试剂盒测定上清液蛋白浓度。参照试剂盒说明书，分别采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定小鼠肺组织MDA水平，WST-8法测定小鼠肺组织中总SOD活性。

1.2.4 PASMCs培养 PASMCs采用配制好的hPASMCs培养基(由基础平滑肌培养液、2.0%胎牛血清、0.5%平滑肌细胞生长因子和0.5%青霉素/链霉素双抗混合制成)培养，每2天换液1次，待细胞生长达80%～90%，以0.25%胰蛋白酶消化分散细胞，离心后重悬，并进行传代培养，传代培养至第2～5代细胞即可用于后续实验。将实验细胞接种于培养皿中，采用不含胎牛血清的无酚红DMEM培养基培养24 h，待细胞同步化后随机分成常氧组(n=3)、低氧组(n=3)、低氧+TanⅡA组(n=3)，TanⅡA浓度参照文献[8]设定为5 μg/mL，每组设置3个复孔，其中常氧组置于37 ℃、5%CO2、95%空气的培养箱内培养24 h；低氧组和低氧+TanⅡA组放置于3%O2、5%CO2、95%N2低氧培养箱内培养24 h。

1.2.5 免疫印迹法(WB)检测Bax、P62及P-Akt及Akt表达 24 h培养结束后，将预冷好的PBS溶液适量加入“1.2.4”项下3组细胞培养皿中，轻轻摇动培养皿后弃去PBS，以上过程重复3次。洗净培养皿内原培养液后，每个培养皿中加入适量含苯甲基磺酰氧(PMSF)的RIPA裂解液(1 mL裂解液中加入10 μL PMSF)，摇匀后置于冰上裂解30 min，采用洁净的细胞刮轻轻将细胞完全收刮于培养皿一侧，并用移液枪转移至已标记好的1.5 mL EP管内，整个过程在冰上操作。将含有细胞裂解蛋白的EP管放入预冷好的离心机内离心15 min，4 ℃，12 000 r/min，取上清液转移至新的1.5 mL EP管内做好标记置于冰上。取上述上清液适量，采用蒸馏水稀释12.5倍后进行蛋白浓度测定。取50 μg蛋白样品，10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳，200 mA恒流转膜适当时间，将目的蛋白转移至聚偏二氧乙烯(PVDF)膜上，裁膜后在常温摇床上5% BSA封闭缓冲液中封闭1 h，后将条带分别浸于Bax(1∶2 000)、P62(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、P-Akt(1∶2 000)的一抗稀释液中4 ℃冰箱内孵育过夜。洗膜3次，每次10 min，常温下辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗稀释液中孵育1 h，再洗膜3次，每次10 min。显色液显色后转至暗箱内进行化学发光显影，应用Image J软件分析各目的蛋白及内参GAPDH的灰度值，两者灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 TanⅡA对3组小鼠RVSP的影响

4周造模结束后，低氧组小鼠意外死亡1只，常氧组及低氧+TanⅡA组小鼠均成功存活。右心导管测压结果显示，与常氧组比较，低氧组小鼠RVSP增加(t=9.149，P<0.05)；与低氧组比较，低氧+TanⅡA组RVSP降低(t=2.963，P<0.05)。见表1。

表1 TanⅡA对3组小鼠RVSP的影响

2.2 HE染色下3组小鼠肺组织病理学改变比较

常氧组小鼠肺组织结构正常，肺小动脉具有完整内膜及正常平滑肌肌层组织，管壁周围几乎无炎症细胞浸润。与常氧组比较，低氧组可见肺小动脉内膜不光滑，管壁和平滑肌肌层组织增厚，血管腔减小，管壁周围可见大量炎细胞浸润。与低氧组比较，低氧+TanⅡA组病理改变减轻，肺小动脉内膜不光滑，管壁和平滑肌肌层组织有一定程度增厚，血管腔减小，管壁周围炎细胞浸润减少，见图1。

常氧组 低氧组 低氧+TanⅡA组

2.3 3组小鼠肺组织中MDA含量及SOD活性变化比较

与常氧组比较，低氧组小鼠肺组织中MDA含量增加，SOD活性下降(t分别为3.164及4.446，P均<0.05)。与低氧组比较，低氧+TanⅡA组小鼠肺组织中MDA含量减少，SOD活性增加(t分别为2.306及3.058，P均<0.05)。见表2。

表2 3组小鼠肺组织中MDA含量及SOD活性变化比较 mg/prot

2.4 3组PASMCs中Bax、P62及PI3K/Akt信号通路中P-Akt蛋白表达水平比较

与常氧组比较，低氧组PASMCs中Bax蛋白表达降低，P62蛋白表达增加(t分别为47.930、19.110，P均<0.05)；与低氧组比较，低氧+TanⅡA组PASMCs中Bax蛋白表达增加，P62蛋白表达降低(t分别为4.218、8.700，P均<0.05)。与常氧组比较，低氧组PASMCs中P-Akt/Akt值增加(t=7.463，P<0.05)。常氧组与低氧+Tan Ⅱ A组P-Akt/Akt值比较差异无统计学意义(t=0.266，P>0.05)。与低氧组比较，低氧+TanⅡA组PASMCs中P-Akt/Akt值降低(t=6.906，P<0.05)。见表3。

表3 3组PASMCs中Bax、P62及PI3K/Akt信号通路中P-Akt蛋白表达水平比较

3 讨论

PAH是一个发病机制复杂、起病隐匿的全球性健康问题，在任何年龄段均可发生，流行病学显示，全球PAH发病率约1%[8]。异常增高的肺血管阻力和肺动脉压力为PAH的主要特征，这种压力的持续增高与血管周围炎症反应、PASMCs增殖异常、肺血管重塑以及血管异常收缩等多种因素相关[9-10]。PAH的定义为平均肺动脉压>25 mm Hg，正常肺毛细血管楔压<15 mm Hg，且肺血管阻力>3 WU，目前诊断肺动脉高压金标准是右心导管检查[11]。

本研究采用慢性低氧性PAH模型，选用体型较小，遗传稳定性较高的C57BL6小鼠，这种模型是基于薛全福等[12]的研究方法加以改造。低氧性PAH主要病理生理特征是肺血管收缩和肺血管重构[13]。本研究结果显示，随着低氧时间延长，低氧组小鼠进食量、进水量、活动量减少，精神状态逐渐变差，但低氧组体质量较常氧组改变不明显；肺组织切片HE染色结果提示，与常氧组比较，低氧组肺血管壁和平滑肌肌层组织增厚、血管腔减小、管壁周围大量炎性细胞浸润，提示低氧导致肺血管重构，与国外低氧建立小鼠PAH模型结果相似[14]。基于本课题组前期造模方法[15]及右心导管测压、肺组织HE染色结果，本研究低氧诱导的小鼠PAH模型成功建立。同时，肺组织切片HE染色结果提示，与低氧组比较，低氧+TanⅡA组管壁和平滑肌肌层组织增厚程度减轻、管壁周围炎细胞浸润减少。右心导管测压结果显示，与常氧组比较，低氧组小鼠RVSP增加；与低氧组比较，低氧+TanⅡA组RVSP降低，表明TanⅡA可改善低氧状态下的肺血管重塑，减轻低氧PAH中右心室收缩压。本研究结果显示，低氧组小鼠肺组织中SOD活性较常氧组下降，而MDA含量增加，低氧+TanⅡA组小鼠肺组织中SOD活性较低氧组增加，MDA含量降低，提示TanⅡA减少低氧PAH中氧化应激水平，与既往研究[16]结果一致。有研究[17]显示，氧化应激在PAH发生发展中发挥着十分重要的作用。在PAH中，SOD活性下降，氧自由基清除能力下降，MDA含量增加，并与氧自由基等物质结合，促进PASMCs异常增殖，加重肺动脉内皮损伤，同时通过激活基质金属蛋白酶(MMP)参与细胞外基质沉积，促进肺血管重构。因此，本研究中TanⅡA通过降低PAH中氧化应激水平，减轻低氧PAH中肺血管重构，达到治疗PAH的作用。

早在1891年，Romberg E等[18]提出PAH患者肺部血管存在闭塞性病变和中层增厚现象，ARCHER S L等[19-21]先后使用来源于PAH患者的原代细胞模型或动物模型的数据证明，PAH中PASMCs、肺动脉内皮细胞(PAECs)和成纤维细胞中均存在一种增殖失衡，凋亡抵抗的类癌现象。He Y等[22]通过体外低氧条件下原代PASMCs培养发现低氧组PASMCs中Bax表达低于常氧组。Yang C等[23]在低氧诱导PAH大鼠实验中发现，与对照组比较，低氧组肺组织中细胞凋亡指数下降，通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA表达水平发现低氧组肺组织中Bcl-2表达高于对照组，而Bax表达低于对照组。Lu J Y等[24]在研究Na+/H+交换器-1(NHE-1)抑制剂时发现，NHE-1抑制通过阻止低氧时PASMCs的Ca2+增加，导致Bcl-2表达降低及Bax表达增加从而诱导和促进低氧培养下的PASMCs凋亡，表明低氧抑制Bax/Bcl-2值增加的促凋亡作用。本研究结果显示，低氧组PASMCs中Bax表达低于常氧组，与Lu J Y等[24]研究一致，低氧环境下PASMCs凋亡减少。本研究结果表明，与低氧组比较，低氧+Tan Ⅱ A组PASMCs中Bax表达增加，提示Tan Ⅱ A通过改善低氧诱导下Bax/Bcl-2值的降低，部分逆转低氧诱导的PAH中PASMCs凋亡的减少，从而发挥减少低氧PAH中肺血管重构的作用。

自噬与凋亡是维持自身稳态的重要生理过程。自噬失调参与多种疾病的发生，近年来自噬在PAH中的作用也被广泛研究[25-27]，但目前自噬在PAH的确切作用尚不明确。有研究[28]显示，激活自噬在PASMCs的作用是促增殖的促生存机制，促进肺血管重构。同时，有研究[29-31]发现，自噬在PAH患者和缺氧诱导的PAH大鼠及小鼠模型的PASMCs表达增加，自噬标记蛋白LC3 Ⅱ / Ⅰ值增加，P62蛋白表达下调。本研究结果显示，低氧组PASMCs中P62蛋白表达较常氧组增加，与Li L等[30]研究结果不一致，可能的原因为：(1)P62表达水平与细胞密度相关[32]，因此，细胞培养初始接种的细胞密度可能影响P62的表达差异；(2)氧化损伤可激活红系衍生的核因子2相关因子(Nrf2)上调P62蛋白的表达保护血管平滑肌细胞[33]；(3)可能与PAH中自噬呈现动态变化过程有关[34]；(4)其他实验条件的不同也可能引起差异(如氧浓度等)。此外，本研究结果显示，低氧+TanⅡA组PASMCs中P62蛋白表达较低氧组降低，表明TanⅡA显著抑制低氧条件下PASMCs中P62蛋白的表达。

PI3K/Akt信号转导通路广泛存在于细胞中，参与细胞生长、增殖、分化等多种生理活动。有研究[35]表明，缺氧激活PI3K/Akt信号通路，活化的PI3K作用于膜上磷脂产生第二信使，然后使丝氨酸/苏氨酸激酶活化，活化后的Akt从细胞质转移到细胞膜上，通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，包括Bcl-2家族蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase 9)等，并通过这些蛋白调节细胞的增殖、凋亡及迁移等。如依赖PI3K的Akt激活后可使Bax、丝氨酸(Ser)184残基磷酸化从而导致Bax失活，同时使Bad的Ser136/Serl12残基磷酸化，导致Bad与Bcl-2解聚，解聚后的Bad与抗凋亡结合蛋白14-3-3结合，而解聚后的Bcl-2则发挥抗凋亡作用，从而抑制细胞凋亡[36]。

此外，PI3K/Akt通路参与肺动脉高压中肺血管重构及其进展。Fan Z等[37]指出PI3K/Akt通路参与肺动脉高压中PASMCs细胞骨架重排和表型转换，而PASMCs表型转换在肺动脉高压进展中发挥着重要作用[38]。Chai X等[39]发现，低氧通过激活PI3K/Akt信号通路诱导PAH大鼠肺动脉成纤维细胞增殖、迁移和分化及低氧性肺血管重构。Xia X D等[40]应用PI3K抑制剂及赖氨酸氧化酶抑制剂，可有效抑制低氧诱导的大鼠肺动脉压力升高及肺血管重构。本研究结果显示，低氧组PASMCs中P-Akt/Akt值高于常氧组，表明低氧激活PAH中PI3K/Akt信号通路，与既往研究结果一致[22,40]。低氧+TanⅡA组PASMCs中P-Akt/Akt值较低氧组降低，提示TanⅡA抑制低氧诱导下PAH中PI3K/Akt信号通路的激活，同时本研究中低氧+TanⅡA组PASMCs中Bax表达较低氧组增加，结合前文所述，缺氧激活PI3K/Akt信号通路调节细胞凋亡，因此考虑TanⅡA可能通过抑制低氧诱导下PI3K/Akt信号通路的激活，使促凋亡蛋白Bax失活减少，从而部分逆转低氧状态下PASMCs凋亡减少，改善低氧PAH中肺血管重构。

综上所述，TanⅡA具有保护低氧PAH的作用，可能与TanⅡA减轻低氧PAH中氧化应激水平及抑制低氧PASMCs中PI3K/Akt信号通路的激活，部分逆转低氧状态下PASMCs凋亡的减少，改善PAH中肺血管重构有关。本研究可为临床应用TanⅡA治疗PAH提供参考。